張 昊 張長春 朱 坤 許 剛

生長分化因子6(growth differentiation factor 6，GDF6)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)的成員之一，亦稱為BMP13。BMP 與轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)相比，兩者含有20%～30%的同源氨基酸。在最初被發(fā)現(xiàn)的時候，BMP 被認(rèn)為是去礦化骨基質(zhì)的組件，當(dāng)發(fā)生異位植入或者骨折時，能刺激新骨組織的產(chǎn)生［1］。BMP 主要參與細(xì)胞的分化與增殖。在胚胎發(fā)育、維持及胚胎干細(xì)胞分化的過程中受很多GDF 控制，尤其是TGF-β 超家族成員如BMP及活化素［2］。BMP 的生物學(xué)功能近年來成為研究的熱點，由于BMP 的表達(dá)及其受體在眾多類型的細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，表明BMP具有比目前所認(rèn)知的更為復(fù)雜的功能。隨著重組DNA 技術(shù)的發(fā)展，一些BMP 亞型已被合成，并應(yīng)用于實驗室和醫(yī)學(xué)的許多學(xué)科，如骨移植［3］?，F(xiàn)將GDF6 的研究進(jìn)展綜述如下。

1 BMP 家族的生物學(xué)性質(zhì)

Mulloy 等［4］的研究表明當(dāng)細(xì)胞發(fā)生特定分化途徑時，BMP發(fā)揮著核心作用。這些蛋白通過Smad 信號途徑調(diào)解靶基因的表達(dá)，其中Smad 蛋白是細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵分子，發(fā)揮著從細(xì)胞膜到細(xì)胞核信號傳輸TGF-β 超家族成員的功能。TGF-β 配體通過結(jié)合I 型和II 型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體四聚體啟動信號傳導(dǎo)，這將使Smad 蛋白磷酸化［5］。從人的基因組中關(guān)于I 型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的研究結(jié)果表明，共有7 種Ⅰ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體被指定為活化素受體樣激酶(activin receptor-like kinases ALKS)，這些I 型受體分別是TGF-β(ALK5 和ALK1)，激活素(ALK4)，BMP/GDF(ALK3、ALK6 和ALK2)，和節(jié)點(ALK7)［6］。另一方面，同樣存在5 種Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，包括TGFRII 對于TGF-β，ActRIIA、ActRIIB 對于激活素類及一部分BMP、BMPRII 對于BMP，AMHRII 對于抗苗勒激素［5，7］。在BMPs 亞科中有一個類似的分子結(jié)構(gòu)，它有可能使一些BMP 與數(shù)量有限的受體相互作用，例如BMP9、BMP10、BMP13 和BMP14 彼此共享51%氨基酸序列。雖然對于BMPs 來說Ⅰ型和Ⅱ型受體具有相似親合性，但這兩種類型的受體均需要傳導(dǎo)信號的誘導(dǎo)［5］。此外，雖然各BMP 與其相應(yīng)的受體相結(jié)合，但是在不同的BMP 及其受體之間也存在一些交互作用［8］。

TGF-β 家族的Ⅰ型和Ⅱ型受體通過啟動兩種不同的下游Smad 信號途徑進(jìn)行傳導(dǎo):BMPs 通過Smad1/5 途徑，TGF-β 通過Smad2、3 途徑［5，9］。Smad 蛋白是細(xì)胞內(nèi)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移TGFβ 超家族成員信號到細(xì)胞核的關(guān)鍵分子。在當(dāng)前，已經(jīng)有8 種Smad 蛋白被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)它們的功能可分為3 類:①受體相關(guān)的Smad 蛋白(receptor-associated Smad，R-Smad)，其中包括Smad1、2、3、5 和8;②共同介導(dǎo)的Smad 蛋白(common-mediated Smad，co-Smad)即Smad4;③抑制的Smad 蛋白，包括Smad6 和7［5，10］。通常認(rèn)為Smad1、5 和8 調(diào)解BMP 的信號傳導(dǎo)，而Smad2 和3 涉及對TGF-β 信號通路的作用，而這些途徑均通過Smad4 作為中介進(jìn)行傳導(dǎo)［8］。在與特殊的配體結(jié)合后，并和受到刺激的Ⅱ型受體結(jié)合形成二聚體，然后在Ⅰ型受體富含GC 的區(qū)域使其磷酸化，激活并形成絲氨酸/蘇氨酸激酶。這些受體在被激活后將會招募并磷酸化R-Smad，使其成為一種直接的基質(zhì)，然后磷酸化后的R-Smad 將會從細(xì)胞膜分離并與共同介導(dǎo)的Smad(Smad4)結(jié)合，形成異三聚體。磷酸化后的R-Smad 和co-Smad復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中特定的DNA 結(jié)合位點結(jié)合，并與一些其他的轉(zhuǎn)錄因子(如共活化劑和共抑制劑)相互作用以調(diào)解靶基因的表達(dá)［11］。

BMP 信號在細(xì)胞中被限制在多種水平，包括細(xì)胞內(nèi)抑制的Smad 蛋白［12］、miRNA 和甲基化作用，以及細(xì)胞外的偽受體如BMP 和活化膜結(jié)合抑制劑［13，14］。BMPs 的信號傳導(dǎo)異常會導(dǎo)致多種類型的疾病，包括癌癥和異位骨化，BMPs 的信號傳導(dǎo)也通過拮抗劑來調(diào)節(jié)［15］。BMPs 拮抗劑與BMPs 蛋白質(zhì)同源，擁有一個類似“半胱氨酸殘基”的結(jié)構(gòu)，它們是TGF-β 超家族的一部分［16］，可以有效地結(jié)合BMPs 受體以阻止BMPs 與其他受體相結(jié)合。BMP 拮抗劑控制BMP 各個方面的功能，包括影響對組織的重建。它們結(jié)合到BMP 的配位體，防止與細(xì)胞表面受體的相互作用，從而阻斷細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)［17］。BMPs 拮抗劑可作為BMPs 配體的開關(guān)發(fā)揮作用，由于一些BMP 的功能會過表達(dá)，所以在特定的時間阻止某些BMP 是必要的［18］。

2 GDF6 的生物學(xué)功能

最初GDF6 是從牛的軟骨中分離、鑒定出的，并首次定義為軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白-2，它主要在關(guān)節(jié)及環(huán)狀軟骨中表達(dá)，并且在其他組織如腸、骨骼肌和胎盤中也有少許表達(dá)［19］。

2.1 GDF6 能抑制骨的形成BMP 在很大程度上與誘導(dǎo)骨的形成相關(guān)［8］。不過更多的證據(jù)表明GDF6 可以防止或延緩骨組織的形成。Shen 等［20］研究發(fā)現(xiàn)GDF6 具有能抑制人骨髓中的多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞在體外向成骨方向分化的作用。當(dāng)添加GDF6 時可下調(diào)重要的成骨標(biāo)記基因如Runx2，骨橋蛋白和堿性磷酸酶的表達(dá)，特別是與添加BMP7 的對照組相比較時。而在成骨條件及含有GDF6 的刺激下，多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞能被誘導(dǎo)表達(dá)高水平的蛋白聚糖。Clendenning 等［21］在對GDF6-/-基因敲除的小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，在早期的顱骨發(fā)育過程中，GDF6 能阻止冠狀縫間質(zhì)的分化。他們發(fā)現(xiàn)顱骨的頂葉和額葉之間的邊界并未形成，而是形成連續(xù)性的骨組織，從而認(rèn)為是因為在它們之間產(chǎn)生了異位骨化。GDF6 基因缺陷的小鼠在顱骨骨縫結(jié)合區(qū)域表達(dá)出更高的成骨標(biāo)記基因堿性磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子Runx2，提示成骨組織的形成。Clendenning 的數(shù)據(jù)顯示，GDF6 可以自我調(diào)節(jié)表達(dá)，在構(gòu)建顱縫處的細(xì)胞中減少骨特征性標(biāo)記基因堿性磷酸酶和Runx2 的表達(dá)。

2.2 GDF6 促進(jìn)軟骨的表達(dá)在胚胎發(fā)育、生長及骨的愈合過程中，軟骨的形成是生成骨組織的必要中介［22］。GDF6 在最初因其序列同源性被認(rèn)為是BMPs 家族成員之一，不過其活性在軟骨中更突出［23］。而且GDF6 已被證明在體外［24］和體內(nèi)［25］均能刺激軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)。在體外通過對軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)，并予以重組GDF6 刺激，經(jīng)阿爾新藍(lán)染色及組織濕重變化的檢測發(fā)現(xiàn)聚集蛋白聚糖的表達(dá)增加［24］。Heckmann等［26］將人的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞接種在含聚-L 乳酸的三維立體系統(tǒng)中，并添加GDF6 刺激因子，在培養(yǎng)14 d 后，通過RT-PCR、免疫組化和明膠酶譜檢測發(fā)現(xiàn)，GDF6 能促進(jìn)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的膠原蛋白的表達(dá)。

2.3 GDF6 在肌腱及韌帶中的作用將GDF6 轉(zhuǎn)基因?qū)腴g充質(zhì)干細(xì)胞和十字韌帶成纖維細(xì)胞中來誘導(dǎo)韌帶組織的分化，研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一種韌帶樣基質(zhì)，富含膠原蛋白、波形蛋白、纖連蛋白、核心蛋白聚糖、彈性蛋白腱生蛋白等，從而認(rèn)為含有GDF6 基因的間充質(zhì)干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞能夠分化為韌帶樣組織［27］。組織移植實驗研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)異位注射GDF6 能刺激肌腱［28］和韌帶［29］的生成。此外，將GDF6 轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞植入家兔體內(nèi)人工誘導(dǎo)的動脈瘤中發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)局部膠原蛋白的產(chǎn)生［30］。但在不同物種和不同組織中GDF6 的效果是不同的。與對照組的小鼠相比，GDF6 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞并未能改善肩袖損傷的情況［31］。但是通過加入外源性GDF6 基因?qū)ρ颍?2］和小鼠［31］跟腱損傷的愈合情況的研究發(fā)現(xiàn)，受損跟腱的愈合效果較為顯著。在雙敲除GDF6 基因的小鼠中，不同的肌腱受到了不同的影響，對于尾腱生長的影響較跟腱更明顯，小鼠尾腱的生長是受抑制的［33］。Mikic 等［34］研究發(fā)現(xiàn)GDF6 缺乏對肌腱的影響跟性別相關(guān)，但是對于其中雌性GDF6 基因雙敲除小鼠來說，肌腱成分或材料性質(zhì)的差異未檢測出。而且相較于跟腱，尾腱中顯示出更大的影響，這與GDF5 缺乏的對照組的結(jié)果是相反的。

2.4 其他相關(guān)影響GDF6 同樣在其他組織中表達(dá)及產(chǎn)生相關(guān)作用，Chen 等［35］對經(jīng)GDF6 誘導(dǎo)的C3H10T1/2 細(xì)胞體外培養(yǎng)28 d 后，通過RT-PCR、免疫印跡和熒光免疫檢驗法檢測心肌特異性基因、肌鈣蛋白T 和連接蛋白43 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，GDF6 能促進(jìn)C3H10T1/2 分化為心肌樣細(xì)胞。Asai-Coakwell 等［36］的數(shù)據(jù)表明GDF6 基因突變導(dǎo)致雷伯氏先天性黑蒙，此外GDF6 的缺乏可能與光感受器的變性相關(guān)。同時Asai-Coakwell 等［36］通過對小鼠和斑馬魚的突變型模型觀察后發(fā)現(xiàn)它們的視網(wǎng)膜細(xì)胞在逐漸凋亡，而這是人類視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的一個特征，從而認(rèn)為GDF6 有助于早發(fā)性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的治療。Zhang 等［37］認(rèn)為GDF6 參與了外胚層的構(gòu)成及眼的發(fā)育，GDF6 基因突變可能與眼睛發(fā)育異常相關(guān)聯(lián)如小眼畸形或無眼畸形;且GDF6是年齡相關(guān)性黃斑變性的一種新的致病基因。而GDF6 在椎間盤退變中也產(chǎn)生相應(yīng)的影響，Wei 等［25］在對綿羊椎間盤損傷的模型的研究中發(fā)現(xiàn)，將GDF6 注入受損的椎間盤中，GDF6 能阻止甚至逆轉(zhuǎn)相關(guān)組織學(xué)變化如細(xì)胞外基質(zhì)的損失，保留更強(qiáng)的水合作用以及在髓核組織中含有更多的細(xì)胞等，從而認(rèn)為GDF6 可以作為一種促進(jìn)椎間盤恢復(fù)的治療因子。Clarke 等［38］將人間充質(zhì)干細(xì)胞接種于Ⅰ型膠原凝膠并在添加GDF6 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，然后通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測軟骨和髓核的標(biāo)記基因的表達(dá)以及硫酸化糖胺聚糖含量的變化，實驗顯示間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)GDF6 誘導(dǎo)后被分化為一個髓核細(xì)胞樣表型及富含更多的蛋白聚糖的基質(zhì)。因此，這種間充質(zhì)干細(xì)胞和GDF6 的組合可以是一種治療椎間盤退變的理想選擇。

GDF6 已經(jīng)在不同的物種、組織中被發(fā)現(xiàn)相關(guān)的表達(dá)及功能，但相較于其他家族成員來說，對其的研究相對較少。從目前來看，對GDF6 的研究在肌腱、韌帶、軟骨組織及抑制骨形成中成果較多。近年來，隨著對椎間盤退變的研究逐漸增多，GDF6 在椎間盤中的表達(dá)及相連的功能已有相關(guān)報道［23，25，38］，GDF6 可以作為一種相關(guān)治療因子，通過對它的深入研究，相信在不久的將來可以對椎間盤退變的治療有積極作用。

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