宮頸癌分子遺傳機(jī)制及其相關(guān)基因功能研究

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宮頸癌分子遺傳機(jī)制及其相關(guān)基因功能研究

張懷念，張?jiān)伬?/p>

(廣東藥學(xué)院，廣東 廣州510006)

摘要:宮頸癌是婦科中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第二，僅次于乳腺癌。目前宮頸癌的治療效果并不佳，并且其具體的致病機(jī)制尚不清楚。為了闡述對(duì)宮頸癌預(yù)防及治療有意義的新的靶點(diǎn)，該文主要從分子水平綜述其相關(guān)致病機(jī)制及其涉及到的相關(guān)基因。目前研究比較新的宮頸癌發(fā)病機(jī)制涉及有微小RNA(mi RNA)，DNA甲基化等方面，這些基因靶點(diǎn)在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后等各個(gè)環(huán)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞:宮頸癌；致病機(jī)制；相關(guān)基因；微小RNA；DNA甲基化

宮頸癌是全球女性中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其嚴(yán)重的影響到了婦女的生命活動(dòng)[1-2]。在中國(guó)，每年大約有13.5萬(wàn)新病例和8萬(wàn)人由于宮頸癌疾病而死亡，此外，在年輕的中國(guó)女性中(小于30歲)，宮頸癌的發(fā)病率以每年2%~3%持續(xù)增加[3]。雖然人類乳頭瘤病毒(HPV)被認(rèn)為是宮頸癌的主要致病因素，然而，病毒感染本身不足引起癌癥的發(fā)生。宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尤為復(fù)雜，對(duì)女性危害極為嚴(yán)重，因此準(zhǔn)確地了解宮頸癌致病的分子機(jī)制，對(duì)宮頸癌預(yù)防、治療是必不可少的[4]。近些年來(lái)，mi RNA、DNA甲基化等在宮頸癌發(fā)病中的作用成為關(guān)注的熱點(diǎn)，因此，本文就其二者在宮頸癌發(fā)病中的研究現(xiàn)狀加以綜述。

1mi RNA在宮頸癌致病機(jī)制研究中的應(yīng)用和進(jìn)展

1.1mi RNA概述mi RNA是在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性的起著調(diào)控作用的單鏈非編碼 RNA，長(zhǎng)約22～25個(gè)核苷酸。由內(nèi)含子中的mi RNA轉(zhuǎn)錄形成原始的mi RNA，經(jīng)過(guò)一系列剪切加工成成熟的 mi RNA，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，再通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶m RNA 結(jié)合，最終參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控。相關(guān)研究表明，50%以上mi RNA基因定位于基因脆性位點(diǎn)或腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域，mi RNA通過(guò)促使靶m RNA降解或抑制其翻譯來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、機(jī)體代謝以及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5]。鑒于一些mi RNA基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)表觀遺傳機(jī)制的，提出了mi RNA的啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)改變，引起mi RNA的異常表達(dá)可能是宮頸癌的一種致病機(jī)制[6]。 因此，mi RNA在宮頸癌組織中的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，可能在宮頸癌的致病機(jī)制中起著致癌基因或者抑癌基因的作用。

1.2mi RNA在宮頸癌中的檢測(cè)技術(shù)Micro RNA是一種約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的內(nèi)源性RNA堿基對(duì)，參與蛋白質(zhì)的編碼，并引導(dǎo)這些mRNA的轉(zhuǎn)錄后抑制[7]。目前在宮頸癌研究中，常用于miRNA檢測(cè)的方法主要有miRNA分子克隆和測(cè)序、RNA 印跡技術(shù)、引物延伸基因芯片以及實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(q RT-PCR)等。當(dāng)前宮頸癌研究中應(yīng)用最廣泛的是借助基因芯片技術(shù)進(jìn)行miRNA 檢測(cè)，然后利用q RT-PCR驗(yàn)證芯片研究的結(jié)果。此外，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，原位雜交技術(shù)也逐步應(yīng)用于mi RNA在宮頸癌中的檢測(cè)。

1.3mi RNA在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中相關(guān)基因的研究Tao Tang[8]等采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，通過(guò)聚類分析的方法在宮頸癌的mi RNA表達(dá)譜中，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)上調(diào)(mi R- 182 and 183 )和9個(gè)下調(diào)(mi R-211,145,223,150,142-5p,328,195,199b,142-3p)mi RNA，并通過(guò)原位雜交、Western blot、流式細(xì)胞儀等技術(shù)最終篩選出mi RNA-182，并證實(shí)了最上調(diào)的mi RNA-182在宮頸癌中表達(dá)顯著升高，并發(fā)現(xiàn)了mi R-182與宮頸癌晚期的表達(dá)增加顯著相關(guān)，并且mi R-182在宮頸癌細(xì)胞系中與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期信號(hào)通路有關(guān)。最終結(jié)果表明mi R-182起著致癌作用，其發(fā)病機(jī)制與破壞宮頸癌細(xì)胞增殖有關(guān)。蓋紅霞[9]等通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-218的相對(duì)表達(dá)量，初步探討其表達(dá)與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果表明，宮頸癌組織的 mi R-218表達(dá)量相對(duì)正常宮頸組織有所下降。因此mi R-218表達(dá)水平下調(diào)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展 、轉(zhuǎn)移和侵襲等有關(guān)，為宮頸癌的治療提供了新靶點(diǎn)，并可能作為其治療及預(yù)后評(píng)價(jià)的一個(gè)重要參考指標(biāo)。韋麗婭[10]等通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選出上調(diào)基因mi R-205，對(duì)miRNA上調(diào)表達(dá)的HeLa細(xì)胞基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在mi R-205上調(diào)表達(dá)的HeLa細(xì)胞中有差異表達(dá)的基因共 172 條，其中34條上調(diào)，138條下調(diào)。因此應(yīng)用基因芯片技術(shù)可以有效的篩查出 mi R-205 上調(diào)表達(dá)后，在宮頸癌細(xì)胞株中存在差異表達(dá)的基因，并且mi R-205 引發(fā)宮頸癌疾病是由多因素多基因共同作用的結(jié)果。Y Shen[11]等應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出異常表達(dá)的mi R-375基因，并利用q RT-PCR等技術(shù)，最終發(fā)現(xiàn)在紫杉醇治療宮頸癌時(shí)mi R-375表達(dá)升高。因此，mi R-375基因可能作為紫杉醇治療宮頸癌時(shí)的有一個(gè)有效治療靶點(diǎn)。

2DNA甲基化在宮頸癌致病機(jī)制研究中的應(yīng)用和進(jìn)展

2.1DNA甲基化概述DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下，選擇性的將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基團(tuán)結(jié)合到Cp G二核苷酸的胞嘧啶上，形成5’-甲基胞嘧啶的過(guò)程。其中DNA甲基化主要發(fā)生在Cp G二核苷酸位點(diǎn)。甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平的降低和 5'-GC-3'核苷酸島局部甲基化水平的異常升高，導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定從而誘發(fā)細(xì)胞癌變。其異常高甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活以及異常低甲基化所致原癌基因激活已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[12]。

近些年，國(guó)內(nèi)外對(duì)宮頸癌的DNA甲基化研究逐漸增多，在宮頸癌研究中發(fā)現(xiàn)，有多種基因發(fā)生了甲基化，并且這種遺傳學(xué)的改變與宮頸癌的發(fā)生有很大的關(guān)聯(lián)性，以下對(duì)一些可能與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因加以總結(jié)。(1)上皮型鈣黏素(CDH1、CDH13)基因是一種抑癌基因。上皮型鈣黏素是重要的細(xì)胞間黏附分子，其在維持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性上起著重要的作用，其基因的失活則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力降低，這與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中CDH1甲基化可能導(dǎo)致E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)或無(wú)表達(dá)，CDH13則參與細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移過(guò)程，其異常甲基化會(huì)引起鈣介導(dǎo)的細(xì)胞黏附系統(tǒng)失活，此基因可作為一種潛在的評(píng)估發(fā)生宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物；(2)死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK1)[13]是一種促凋亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該基因是一個(gè)參與多種細(xì)胞死亡相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)的抑癌基因，此外，其還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。目前也有大量研究發(fā)現(xiàn)DAPK1的基因啟動(dòng)子的變異性高度甲基化的改變，發(fā)生在多種腫瘤中。DAPK1 啟動(dòng)子 Cp G 島甲基化可導(dǎo)致基因的失活，并可能參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展；(3)Ras相關(guān)區(qū)域家族(1A RASSF1A)是一種腫瘤抑制基因，該基因丟失及表達(dá)改變與多種癌癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，可能是通過(guò)影響細(xì)胞周期發(fā)展、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抗微管解聚等發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用。由于甲基化的 RASSF1A 基因不能正常表達(dá)，從而失去了對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用，使細(xì)胞發(fā)生惡變，進(jìn)而癌變成為惡性腫瘤，是宮頸癌發(fā)病機(jī)制之一。RASSF1A基因的Cp G島啟動(dòng)子區(qū)域的超甲基化與該基因失活有關(guān)，該基因編碼的蛋白與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯有關(guān)；(4)CADM1A是一種位于人類染色體11q23.2中的腫瘤抑制基因，其參與細(xì)胞骨架構(gòu)建和維持細(xì)胞的黏附功能的穩(wěn)定，當(dāng)CADM1A基因啟動(dòng)子的變異性高度甲基化時(shí)會(huì)引起腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲；(5)維甲酸受體 -β(RAR-β)屬于核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑甲狀腺激素受體超家族中一員，通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，限制多種類型細(xì)胞生長(zhǎng)。有關(guān)研究表明RAR-β的甲基化程度隨著宮頸病變的嚴(yán)重程度而上升；(6)P16INK4a(CDKN2a)基因又稱多瘤抑制因子，是一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，其編碼的蛋白為CDK4的抑制劑。其產(chǎn)物P16INK4a蛋白通過(guò)與細(xì)胞周期素D(cyclin D)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合周期蛋白依賴性激酶(CDK4和CDK6)，并特異性抑制CDK4和CDK6激酶的活性，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞過(guò)度增殖，從而抑制腫瘤的發(fā)展，是細(xì)胞周期調(diào)控與癌癥關(guān)系中最直接聯(lián)系的一種腫瘤抑制蛋白。相關(guān)研究表明P16INK4a啟動(dòng)子區(qū)甲基化是P16INK4a基因失活的原因之一，且其表達(dá)和宮頸癌的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)；(7)SOX1(性別決定性基因)編碼SOX家族轉(zhuǎn)錄因子之一，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和決定細(xì)胞存亡。有關(guān)研究表明，SOX1基因在宮頸癌組織中甲基化頻率高于正常宮頸組織，并且差異有顯著性[14-15]。

2.2DNA甲基化在宮頸癌研究中的檢測(cè)方法目前，在宮頸癌研究中，DNA甲基化的檢測(cè)方法主要分為三類：基因組整體水平的甲基化檢測(cè)、基因特異位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)和新甲基化位點(diǎn)的尋找。常用的方法主要有甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法(MS-PCR)、亞硫酸氫鈉-限制性酶切法的引物設(shè)計(jì)、Souther印跡法、實(shí)時(shí)熒光PCR法、DNA序列法、亞硫酸氫鈉-測(cè)序法等[16-17]。

2.3DNA甲基化在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中相關(guān)基因的研究姚紅霞[18]等采用甲基化特異性PCR法和免疫組化法檢測(cè)正常宮頸組織和宮頸癌組織中p16基因甲基化的發(fā)生率以及p16蛋白表達(dá)的缺失率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常宮頸組織中沒(méi)有檢測(cè)到p16基因甲基化，但是在宮頸癌組織中檢測(cè)到，并且p16基因的甲基化發(fā)生率與宮頸癌的癌變程度成正相關(guān)，提示p16基因甲基化與宮頸癌疾病的發(fā)生具有相關(guān)性。巫劍紅[19]等應(yīng)用Cp G島富集化分析甲基化芯片(MIRA)技術(shù)，從正常組織和宮頸癌組織中篩選出異常表達(dá)的甲基化基因，并選取其中甲基化水平較高的性別決定性基因9(SOX9)，接著用亞硫酸氫鈉-限制性酶切法檢測(cè)正常宮頸脫落細(xì)胞和宮頸癌脫落細(xì)胞中的SOX9的甲基化狀態(tài)。最終結(jié)果表明，SOX9在宮頸癌組織中頻繁發(fā)生甲基化，并且其甲基化水平顯著高于正常宮頸組織，因此SOX9可能作為檢測(cè)宮頸癌的一種分子標(biāo)志。張惠嬌[20]等采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)測(cè)定宮頸鱗癌(CSCC組)、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN組)和正常宮頸組織(對(duì)照組)中的RUNX3基因甲基化的狀態(tài)，結(jié)果在CSCC組和CIN組中檢測(cè)出RUNX3基因啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化，而對(duì)照組未檢測(cè)出，因此RUNX3可作為抑癌基因參與宮頸鱗癌的發(fā)生和發(fā)展，也可作為對(duì)宮頸鱗癌患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)指標(biāo)。Lin等[21]采用在宮頸癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)性別決定性基因1(SOX1)過(guò)表達(dá)，對(duì)小白鼠進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)構(gòu)建動(dòng)物模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的SOX1可以抑制宮頸癌細(xì)胞(HeLa，CaSki)的增殖，其中SOX1可以抑制TCF依賴性轉(zhuǎn)錄活性和Wnt靶基因，同時(shí)還通過(guò)調(diào)節(jié)侵襲相關(guān)基因的表達(dá)抑制其侵襲。因此SOX1可以通過(guò)宮頸癌中Wnt或β-catenin的信號(hào)干擾作為腫瘤的一個(gè)抑制基因。

3展望

宮頸癌是影響女性生殖器官最為常見(jiàn)的癌癥之一，它在所有癌癥總體中位列第七，在女性癌癥中位居第二。在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌通常在女性癌癥中最常見(jiàn)，大約占據(jù)女性癌癥的25%。相信隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展和mi RNA、DNA甲基化等方面基因作用機(jī)制的深入研究，基因治療技術(shù)的不斷提高，我們將會(huì)更清楚地了解宮頸癌的發(fā)病原因、致病機(jī)制，為宮頸癌的診斷和治療提供新的依據(jù)和方法。同時(shí)有望對(duì)宮頸癌的病程進(jìn)展和治療愈后在基因和分子水平上作更進(jìn)一步的深入研究,對(duì)宮頸癌早期診斷、早期治療、延長(zhǎng)宮頸癌患者的生存時(shí)間和提高宮頸癌病人的生活質(zhì)量具有重要的意義。

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(收稿日期：2014-07-07，修回日期：2014-07-28)◇藥學(xué)研究◇

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.004

通信作者：張?jiān)伬?，女，教授，研究方向：中藥材抗腫瘤藥效及分子機(jī)制，E-mail：zyl5198@163.com

作者簡(jiǎn)介：張懷念，男，碩士研究生

基金項(xiàng)目：廣東省人口計(jì)生委科研項(xiàng)目(No 2012334)