盛沖霄，黎紅華，劉康，馮海松

大鼠動脈粥樣硬化病變各階段內(nèi)皮依賴性舒張功能以及親環(huán)素A表達的變化

盛沖霄，黎紅華，劉康，馮海松

目的：觀察高脂飲食喂養(yǎng)大鼠動脈粥樣硬化病變各階段內(nèi)皮依賴性舒張功能的改變以及親環(huán)素A（CyPA）的表達變化。

方法：雄性Wistar大鼠30只隨機分為4組，對照組（6只），動脈粥樣硬化8周組（AS 8W組）8只，動脈粥樣硬化12周組（AS 12W組）8只，動脈粥樣硬化15周組（AS 15W組）8只。給予動脈粥樣硬化組高脂飼料喂養(yǎng)，并給予維生素D3注射液60萬IU/kg一次性腹腔注射，對照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。同期處死大鼠，分離腹主動脈，行蘇木素伊紅（HE）染色，免疫組化法檢測動脈壁CyPA的表達。另外截取約5 mm新鮮大鼠腹主動脈環(huán)，在離體器官浴槽中觀察離體腹主動脈環(huán)對乙酰膽堿舒張反應(yīng)。

結(jié)果：隨著造模時間的進展，各組大鼠分別呈現(xiàn)出了血管正常結(jié)構(gòu)、內(nèi)皮細(xì)胞破壞，平滑肌細(xì)胞增生、粥樣斑塊形成以及鈣化斑塊形成等不同的病變特征。內(nèi)皮依賴性舒張功能進行性下降，對照組、AS 8W組、AS 12W組、AS 15W組最大舒張度分別為（93.46±2.80）%、（82.58±3.25）%、（61.19±3.72）%、（41.28±2.68）%，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。血管內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞CyPA的表達不斷增加，四組大鼠CyPA平均光密度測定分別為0.25±0.06、 0.34±0.09、0.53±0.09、0.68±0.13，各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

結(jié)論： CyPA的表達隨著病變進展不斷增加，內(nèi)皮依賴血管舒張功能進行性下降。CyPA的表達與動脈粥樣硬化病變嚴(yán)重程度有關(guān)。CyPA可能是動脈粥樣硬化的始動因素之一。

動脈粥樣硬化；親環(huán)素A ；內(nèi)皮依賴性舒張功能

Methods: A total of 30 male Wistar rats were divided into 4 groups: Control group, the rats received normal diet, and 3 atherosclerosis groups, the rats received high cholesterol diet for different period of time and a single dose intraperitoneal injection of Vitamin D3 at 600,000 IU/kg, as Atherosclerosis at 8 weeks (AS 8W) group, AS 12W group and AS 15W group, n=8 in each AS group. The rats were sacrificed at the same time to isolate aorta abdominalis. The expression of CyPA at the wall of aorta abdominalis was detected by HE staining and immunohistochemistry. In addition, the aorta abdominalises was cut into 5 mm rings to observe its response to acethylcholine in exvivo organ bath.

Results: With prolonged modeling time, the rats at different groups presented normal vessel structure, endothelial cell damage, vessel smooth muscle cell proliferation, atherosclerosis plaque formation and calcified plaque formation for different

pathological characteristics. The endothelial-dependent vasodilatation was decreased and the maximum vasodilatation percentage in Control group, AS 8W group, AS 12W group and AS 15W group were at (93.46 ± 2.80) %, (82.58 ± 3.25) %, (61.19 ± 3.72)% and (41.28 ± 2.68)% respectively, P＜0.05 between each group. The CyPA expression in endothelial cell and vessel smooth muscle cell were increased accordingly in 4 groups by OD value as (0.25 ± 0.06), (0.34 ± 0.09), (0.53 ± 0.09) and (0.68 ± 0.13) respectively, P＜0.05 between each group.

Conclusion: The CyPA expression increased and the endothelial-dependent vasodilatation decreased with the progress of atherosclerosis accordingly in experimental rats. The expression level of CyPA is related to atherosclerosis degree and it is one of the initial factors for atherosclerosis in rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:576.)

動脈粥樣硬化以內(nèi)皮功能障礙為起始事件，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等貫穿了動脈粥樣硬化的發(fā)病過程[1，2]。近年來，親環(huán)素A（cyclophilin A，CyPA）與氧化應(yīng)激、動脈粥樣硬化的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。CyPA被認(rèn)為是重要的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)因子，可在氧化應(yīng)激刺激下由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞分泌[3]。CyPA刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖以及炎癥細(xì)胞遷移，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，參與動脈粥樣硬化的發(fā)病過程[4]。有研究探討了血清CyPA濃度與急性冠狀動脈綜合征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)急性冠狀動脈綜合征患者血清CyPA濃度明顯高于穩(wěn)定性心絞痛和正常對照者血清水平[5]。但是CyPA在動脈粥樣硬化病理過程中各階段的表達變化以及伴隨的內(nèi)皮依賴性舒張功能的變化目前尚少見報道。本研究旨在揭示大鼠動脈粥樣硬化病理過程中CyPA在動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞表達含量的變化，以及相應(yīng)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的變化，為動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：實驗時間為2014-03至2014-07。無特定病原體（SPF）級健康雄性Wistar大鼠30只，體重180～200 g，湖北省實驗動物研究中心提供，分籠飼養(yǎng)在武漢大學(xué)動物實驗中心SPF環(huán)境中，室內(nèi)溫度（22±1）℃,濕度（60±10）%,自由進食水，12 h明暗交替。

主要實驗藥劑：維生素D3注射液（上海通用藥業(yè)），膽固醇、膽酸鈉（武漢凱潤成生物工程有限公司），兔抗CyPA抗體（北京索萊寶科技有限公司），免疫組化SP試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。基礎(chǔ)飼料由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，高脂飼料（81.3%普通飼料、5%蔗糖、10%豬油、3%膽固醇、0.5% 膽酸鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶）由湖北萬千佳興生物科技有限公司加工。

主要儀器：BL-420S 生物機能實驗系統(tǒng)、HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、JH-2型張力換能器，由成都泰盟公司生產(chǎn)。YB-6型生物組織包埋機（上海華巖儀器有限公司），RM2016型Leica石蠟切片機（德國leica公司），OLYMPUS BX51照相顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 方法

所有大鼠經(jīng)3天適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為4組，對照組6只以及動脈粥樣硬化8周組（AS 8W組）8只，動脈粥樣硬化12周組（AS 12W組）8只，動脈粥樣硬化15周組（AS 15W組）8只。各組大鼠造模時間不同，以保證同期處死采集標(biāo)本。造模方法參考文獻[6]。各動脈粥樣硬化組給予高脂飼料喂養(yǎng)，并在分組后第2天給予一次性腹腔注射維生素D3注射液60萬IU/kg。對照組給予普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 取材

同期對各組大鼠進行取材。過量水合氯醛麻醉處死大鼠，快速分離腹主動脈，剔除周圍組織。

離體血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能測定：每條腹主動脈截取約5 mm長血管環(huán)連接到JH-2型張力換能器，置于含Krebs液的HV-4離體恒溫組織器官灌流系統(tǒng)，給予2 g張力負(fù)荷，通入95%O2和5%CO2的混合氣體，在37℃水浴中平衡1 h。以10-6mol/L去甲腎上腺素預(yù)刺激血管環(huán)，張力達平衡后加入不同濃度的乙酰膽堿（10-9～10-4mol/L）, 記錄每一濃度下血管環(huán)的張力，繪制濃度反應(yīng)曲線。

蘇木素伊紅（HE）染色：新鮮腹主動脈以4%多聚甲醛固定48 h后，行石蠟包埋，切片（橫切，片厚2 μm），按照HE染色步驟染色，置于400倍光鏡下觀察并攝片。

免疫組織化學(xué)SP法染色與數(shù)據(jù)采集： 石蠟切片按照免疫組化SP法步驟進行染色。以胞漿胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為CyPA染色陽性。每張切片隨機抽取3個不同的400倍視野。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組化結(jié)果進行分析，測定其平均光密度（平均光密度=累積光密度/測量區(qū)域面積）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 離體動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能測定

在器官浴槽中加入不同濃度（ 10-9～10-4mol/L）的乙酰膽堿后各組大鼠動脈環(huán)均出現(xiàn)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)。如表1所示，對照組動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能良好，最大舒張度達（93.46±2.80）%。而AS 8W組、AS 12W組、AS 15W組最大舒張度都有不同程度下降，AS 15W組下降程度最為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。另外，在加入乙酰膽堿10-9mol/L 、10-8mol/L 、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L濃度后，各組之間舒張度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

表1 不同濃度乙酰膽堿下不同組別大鼠動脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張度的比較

表1 不同濃度乙酰膽堿下不同組別大鼠動脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張度的比較

注： AS：動脈粥樣硬化

?

2.2 大鼠腹主動脈HE染色結(jié)果

光鏡下，對照組腹主動脈內(nèi)膜完整光滑，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，無增生；平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則，無增生；彈性纖維連續(xù)無中斷（圖1A）。AS 8W組可見內(nèi)皮細(xì)胞增生，凋亡，內(nèi)膜失去連續(xù)性；平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂（圖1B）。AS 12W組可見明顯粥樣斑塊形成，內(nèi)膜局部區(qū)域可見明顯炎性細(xì)胞以及泡沫細(xì)胞浸潤，細(xì)胞外基質(zhì)明顯增多，多處內(nèi)膜脫落（圖1C）。AS 15W組可見內(nèi)膜斷裂，中層鈣化斑塊形成，彈性層失去連續(xù)性，可見少量泡沫細(xì)胞形成（圖1D）。

2.3 大鼠腹主動脈CyPA免疫組化檢測結(jié)果

光鏡下觀察各組大鼠腹主動脈CyPA免疫組化染色，可見各組大鼠腹主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞胞漿均有CyPA表達（圖2A～2D）。各組平均光密度結(jié)果： AS 15W組大鼠鈣化斑塊內(nèi)部CyPA表達較對照組升高最為顯著（0.68 ± 0.13 vs 0.25 ± 0.06, P＜0.05），AS 8W組以及AS 12W較對照組CyPA表達明顯升高（0.34±0.09，0.53± 0.09 vs 0.25±0.06, P＜0.05），各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 大鼠腹主動脈切片HE染色（×400）

圖2 大鼠腹主動脈親環(huán)素A免疫組化（×400）

3 討論

CyPA屬于親環(huán)素家族，被認(rèn)為是強效的免疫抑制劑環(huán)孢素A（cyclosporin A,CsA）的胞內(nèi)受體。CyPA具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶活性，在蛋白質(zhì)折疊、運輸、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等方面起了重要作用。氧化應(yīng)激，由于體內(nèi)過多的活性氧物質(zhì)（ROS）而產(chǎn)生，促進了心血管疾病的發(fā)生[7]。Satoh等[8]證實，CyPA可以在氧化應(yīng)激刺激下由血管平滑肌細(xì)胞分泌至胞外。分泌的CyPA通過刺激VSMC增殖以及炎癥細(xì)胞遷移，促進內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及表達白細(xì)胞黏附分子，刺激白細(xì)胞遷移，增強巨噬細(xì)胞的增殖擴散，以及增強血管平滑肌細(xì)胞的促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑促進炎癥反應(yīng)以及動脈粥樣硬化[9]。另外，體外研究也證實了CyPA導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的能力[10]。

本研究使用高脂飼料喂養(yǎng)配合維生素D3注射大鼠建立動脈粥樣硬化模型。高脂飲食可刺激大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高[11]，相伴隨的是CyPA分泌的增多，而分泌的細(xì)胞外CyPA刺激血管平滑肌細(xì)胞中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extrallular signal regul.ated protein kinase1/2，ERK1/2）, 蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（protein-serine-threoninekinase,Akt）和酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）等信號通路,進一步參與了ROS產(chǎn)物的生成，兩者形成惡性循環(huán)[8]。

既往的研究觀察到了動脈粥樣斑塊部位高表達的CyPA，但對于動脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展過程中動脈壁CyPA表達的變化鮮有報道。本研究動態(tài)觀察大鼠動脈粥樣硬化發(fā)展過程中各個階段，通過比較正常、內(nèi)皮改變、動脈粥樣斑塊形成、鈣化等不同時期的大鼠腹主動脈CyPA表達量的差異，明確了CyPA在動脈粥樣硬化疾病發(fā)展過程中的表達變化，證實了CyPA與動脈粥樣硬化疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)隨著造模時間的進展，大鼠腹主動脈正常的結(jié)構(gòu)逐步破壞，至第8周可見內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，內(nèi)皮依賴性舒張功能較正常組下降，這一發(fā)現(xiàn)與國外眾多相關(guān)研究[12,13]所提出的“內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動脈粥樣硬化的早期事件”結(jié)論一致。在這一時期，我們觀察到血管壁CyPA的表達較正常組已有升高。所以，我們認(rèn)為CyPA可能是動脈粥樣硬化的始動因素之一。12周后，隨著CyPA表達水平的進一步升高，刺激炎癥細(xì)胞遷移，加劇炎癥反應(yīng)，血管結(jié)構(gòu)上可見動脈粥樣斑塊形成，斑塊部位可見炎性細(xì)胞浸潤，泡沫細(xì)胞形成，內(nèi)皮依賴性舒張功能相對第8周時明顯下降。隨著炎癥進展，多種炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)了血管壁成骨細(xì)胞的表達和活化，導(dǎo)致鈣質(zhì)沉積[14]。所以，至15周我們觀察到了鈣化斑塊的形成，而CyPA的表達較前一階段有明顯升高。

綜上所述，我們認(rèn)為，高脂飲食誘導(dǎo)了大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高，刺激血管平滑肌細(xì)胞分泌CyPA。而分泌至胞外的CyPA進一步加劇氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進泡沫細(xì)胞形成，逐步導(dǎo)致內(nèi)皮損傷、粥樣斑塊形成、鈣化斑塊形成。我們認(rèn)為CyPA可能是動脈粥樣硬化的始動因素之一,CyPA促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。CyPA與動脈粥樣硬化病變的嚴(yán)重程度有關(guān)，其表達含量隨著病變的進展而隨之升高，CyPA可以成為動脈粥樣硬化預(yù)防和治療的新靶點。

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The Changes of Endothelial-dependent Vasodilatation and Cyclophilin A Expression at Different Phases of Atherosclerosis in Experimental Rats

SHENG Chong-xiao, LI Hong-hua, LIU Kang, FENG Hai-song.
Department of Neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan (430070), Hubei, China

Objective: To observe the changes of endothelial-dependent vasodilatation and cyclophilin A (CyPA) expression at different phases of atherosclerosis in experimental rats.

Atherosclerosis; Cyclophilin A; Endothelial-dependent vasodilatation

2014-09-16）

（編輯：漆利萍）

湖北省自然科學(xué)基金（2013CFB428）

430070 湖北省武漢市，中國人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科

盛沖霄 碩士研究生 主要從事氧化應(yīng)激與動脈硬化研究 Email：474953755@qq.com

黎紅華

Email：Lihonghua567@aliyun.com

R541

A

1000-3614（2015）06-0576-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.06.017