結(jié)直腸癌患者β-纖維蛋白原基因多態(tài)性和血漿纖維蛋白原水平相關(guān)性的研究

王靜文，韓 韜，陳 璽，唐 曦

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院腫瘤科，上海 200040

結(jié)直腸癌患者β-纖維蛋白原基因多態(tài)性和血漿纖維蛋白原水平相關(guān)性的研究

王靜文，韓 韜，陳 璽，唐 曦

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院腫瘤科，上海 200040

背景與目的：結(jié)直腸癌患者病程中常伴有血漿纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)濃度的升高。該研究探討結(jié)直腸癌人群中FGBβ基因-448G/A、-148C/T、-1420G/A、-854G/A的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)頻率分布和血漿Fg濃度的關(guān)系，分析其對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響。方法：采集194例結(jié)直腸癌患者和74例健康者外周血，用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR)法分析FGBβ基因頻率分布，用Clauss凝固法檢測(cè)血漿Fg濃度。結(jié)果：結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組的血漿Fg濃度均較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)。疾病組中FGBβ-148T等位基因頻率和突變型基因頻率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。各組人群中FGBβ-148T攜帶者的血漿Fg濃度均明顯高于非攜帶者(P＜0.05)。在Ⅳ期患者中FGBβ-148C/T突變型者中位PFS較野生型者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論：結(jié)直腸癌患者體內(nèi)Fg濃度升高，提示其可能參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程。FGBβ-148C/T位點(diǎn)的SNP是導(dǎo)致血漿Fg濃度改變的原因之一，但與Ⅳ期患者的預(yù)后無關(guān)。

纖維蛋白原；基因多態(tài)性；結(jié)直腸癌

在引起血漿纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)升高的疾病中，惡性腫瘤占21.1%，是導(dǎo)致血漿Fg升高的首要因素［1］。Fg是由6條多肽鏈［(Aα、Bβ,γ)2］通過二硫鍵連接成的對(duì)稱性二聚體。分別由3個(gè)獨(dú)立的基因編碼：FGA、FGB和FGG。它們集中分布于染色體4q28～4q31約50 kb的區(qū)域內(nèi)。其中因FGB編碼的β鏈?zhǔn)荈g合成的限速步驟而備受關(guān)注［2］。目前的研究多集中于FGBβ基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，認(rèn)為它可以影響血漿Fg的結(jié)構(gòu)、功能和濃度的變化。由于惡性腫瘤患者病程中常伴有血漿Fg濃度的升高，而Fg本身也可能參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程。因此本研究采集結(jié)直腸癌患者外周血標(biāo)本，采用結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQPCR)法檢測(cè)FGBβ基因-448G/A、-148C/T、-1420G/A、-854G/A 4個(gè)位點(diǎn)的SNP，分析其與血漿Fg濃度之間的關(guān)系，并研究其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院2011年1月—2012年12月住院治療的結(jié)直腸癌患者資料共194例。其中結(jié)腸癌102例，直腸癌92例。根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將疾病組患者再分為2組。無轉(zhuǎn)移組：Ⅰ～Ⅱ期無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移且已接受根治性手術(shù)切除的患者共36例，其中男性20例，女性16例，年齡26～77歲，中位年齡58歲。轉(zhuǎn)移組：Ⅲ～Ⅳ期存在淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的患者共158例，其中男性95例，女性63例，中位年齡62歲(37～80歲)。所有患者均由手術(shù)或活檢病理證實(shí)為腺癌。腫瘤轉(zhuǎn)移組及無轉(zhuǎn)移組合稱為疾病組。另取正常對(duì)照組74例，其中男性46例，女性28例，中位年齡58歲(30～82歲)。所有受檢者近3個(gè)月內(nèi)均未用過影響纖溶和凝血的藥物，且無外傷及手術(shù)史。3組人群的年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 試劑與主要儀器

Fg檢測(cè)試劑盒及STA Compact全自動(dòng)凝血分析儀均為法國(guó)Diagnostica Stago公司產(chǎn)品。磁珠法DNA提取試劑盒及SYBR Green Ⅰ染料購自上海灝勤生物科技有限公司。PCR引物由上海生物工程有限公司提供。PCR儀為美國(guó)Bio-Rad CFX產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)本采集與處理

疾病組(在初次接受抗腫瘤藥物治療前或術(shù)前1～3 d)和正常對(duì)照組分別抽取其晨起空腹外周血5 mL，置于含有0.3 mL枸櫞酸鈉(109 mmol/L)的抗凝試管中，混勻。采用Clauss凝固法做血漿Fg的定量分析，F(xiàn)g正常值參考范圍為2～4 g/L。用磁珠法提取全血DNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.4 RTFQ-PCR檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)原理為等位基因特異性PCR(Allelespecific PCR)，即設(shè)計(jì)引物時(shí)選擇在基因組的多態(tài)性區(qū)域，使等位基因的突變定位或接近在引物的3’端。為了提高實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)度，采用RTFQ-PCR技術(shù)檢測(cè)實(shí)時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物(專利號(hào)200810039230.3，上海裕隆生物科技有限公司)。各引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)中使用Taq聚合酶，以U6作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中含10 μL快速熒光定量反應(yīng)預(yù)混液(含SYBR Green Ⅰ染料)，200 nmol/L的上游引物，200 nmol/L的下游引物，200 ng的DNA和超純水。采用兩步法PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，共40個(gè)循環(huán)。融解曲線分析為95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同一個(gè)樣本，同一個(gè)位點(diǎn)，2條基因特異性的前引物各對(duì)應(yīng)1次反應(yīng)。以△Ct(A-G)≤-5為野生純合子，-5＜△Ct≤5為突變雜合子，△Ct＞5為突變純合子(圖1)。

表 1 RTFQ-PCR反應(yīng)中FGBβ基因中4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的引物序列Tab. 1 Primer sequences of FGBβ gene polymorphisms in RTFQ-PCR

圖 1 純合子基因型Fig. 1 Homozygote genotype

1.5 隨訪

對(duì)92例Ⅳ期患者進(jìn)行隨訪。隨訪時(shí)間起止日期為2011年1月—2014年12月，隨訪方式為門診隨訪。無進(jìn)展生存期(progress-free survival，PFS)為患者從接受治療開始至觀察到疾病進(jìn)展或者發(fā)生因?yàn)槿魏卧蛩劳鲋g的這段時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因型頻率及等位基因頻率。基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律及兩組間等位基因頻率的差異比較采用χ2檢驗(yàn)。各組間血漿Fg濃度比較采用t檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組人群血漿Fg濃度比較

腫瘤轉(zhuǎn)移組［(3.56±1.14) g/L］與無轉(zhuǎn)移組［(3.20±0.95) g/L］的血漿Fg濃度均較正常對(duì)照組［(2.67±0.49) g/L］顯著升高(P＜0.05)。但與無轉(zhuǎn)移組相比，轉(zhuǎn)移組血漿Fg濃度的升高并不顯著(P＞0.05)。

2.2 FGBβ-448G/A、-148C/T、-1420G/ A、-854G/A多態(tài)性分布及等位基因頻率

疾病組中148T等位基因頻率顯著高于正常對(duì)照組(表2)。此外，疾病組中-148C/T位點(diǎn)突變型基因的頻率較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。正常對(duì)照組與疾病組之間，F(xiàn)GBβ-448G/ A、-1420G/A、-854G/A，這3個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 基因多態(tài)性與不同組人群血漿Fg濃度的關(guān)系

在各組人群中-148C/T突變型者的血漿Fg濃度均明顯高于野生型者(P＜0.05)。同樣為-148C/T突變型，腫瘤轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組相比血漿Fg濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(3.83± 1.10) g/L vs (3.71±1.25) g/L，P＞0.05］。此外FGBβ-448G/A、-1420G/A及-854G/A的基因野生型和突變型人群之間，血漿Fg濃度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表3)。

表 2 基因多態(tài)性分布及等位基因頻率Tab. 2 Genotype and allele frequencies

表 3 基因多態(tài)性與不同組人群血漿Fg濃度(g/L)的關(guān)系Tab. 3 The relationship between polymorphism and Fg level

表 3 基因多態(tài)性與不同組人群血漿Fg濃度(g/L)的關(guān)系Tab. 3 The relationship between polymorphism and Fg level

*: P＜0.05, compared with wild genotype

Group Control(n =74) Non-metastasis(n=36) Metastasis(n =158) -148C/T Wild genotype(n) 2.52±0.49(50) 2.87±0.51(22) 3.22±1.05(71) Mutant genotype(n) 2.99±0.29(24)* 3.71±1.25(14)* 3.83±1.10(87)*-448G/A Wild genotype(n) 2.68±0.49(52) 3.12±0.76(24) 3.53±1.19(110) Mutant genotype(n) 2.64±0.49(22) 3.34±1.28(12) 3.63±0.93(48) -1420G/A Wild genotype(n) 2.57±0.49(54) 3.18±1.03(30) 3.57±1.15(126) Mutant genotype(n) 2.94±0.36(20) 3.30±0.35(6) 3.52±0.96(32) -854G/A Wild genotype(n) 2.66±0.47(46) 3.32±1.18(21) 3.45±1.13(106) Mutant genotype(n) 2.69±0.52(28) 3.03±0.48(16) 3.78±1.06(52)

2.4 結(jié)直腸癌Ⅳ期患者-148C/T多態(tài)性與生存情況的關(guān)系

92例Ⅳ期患者中-148C/T野生型患者44例，-148C/T雜和、純和突變型患者共48例。突變型患者的血漿Fg濃度較野生型患者明顯升高［(4.08±1.25) g/L vs (3.54±1.17) g/L，P＜0.05］。所有患者均接受姑息性化療，其中野生型組的1年P(guān)FS率為25.0%，突變型組為22.9%，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。用Kaplan-Meier法分析兩組PFS，結(jié)果顯示突變型組較野生型組中位PFS雖有縮短，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5.1個(gè)月 vs 7.6個(gè)月，P＞0.05，圖2)。

圖 2 148C/T野生型和突變型兩組患者PFS的比較Fig. 2 The difference of PFS between 148C/T wild-type and mutant groups

3 討 論

Fg是一種肝細(xì)胞合成和分泌的血漿糖蛋白，其在促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展方面的作用已經(jīng)得到普遍的認(rèn)可。臨床已觀察到肺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤患者術(shù)前血漿Fg濃度的升高與不良預(yù)后有相關(guān)性［3-5］。而且治療前血漿Fg濃度也可以提示放化療或靶向藥物的療效［6-8］。對(duì)于癌癥患者血漿Fg濃度普遍升高這一現(xiàn)象，目前認(rèn)為是因?yàn)榘┘?xì)胞對(duì)正常組織的破壞導(dǎo)致某些炎性因子和組織因子的釋放，進(jìn)而激活凝血過程［9］。作為一種正向反饋，F(xiàn)g會(huì)進(jìn)一步刺激癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，其可能機(jī)制包括：① 作為一種重要的橋連蛋白介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞與血小板之間的黏附［10-11］，有助于瘤栓的形成；② 與血小板形成凝集物后阻擋NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，參與其免疫逃逸的過程［12］；③ 與某些血管生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2結(jié)合，阻止其被降解，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)血管的形成［13］。

本研究利用RTFQ-PCR法檢測(cè)FGBβ基因

-448G/A、-148C/T、-1420G/A、-854G/A位點(diǎn)的SNP。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人群相比，結(jié)直腸癌患者中-148T等位基因頻率及突變基因型頻率均明顯升高(P＜0.05)。攜帶-148T基因的突變型者，在各組人群中其血漿Fg濃度均高于非攜帶者(P＜0.05)。提示-148C/T的SNP可能是調(diào)節(jié)血漿Fg濃度升高的原因之一，這一結(jié)果與以往報(bào)道相一致［14-15］。關(guān)于其機(jī)制，目前研究結(jié)果認(rèn)為，F(xiàn)g的合成受白介素6(interleukin-6，IL-6)的正向調(diào)節(jié)，而FGBβ-148C/T位點(diǎn)靠近IL-6調(diào)控FGBβ基因表達(dá)的受體作用元件。因此FGBβ-148C→T的多態(tài)性改變可能增加了IL-6與受體元件的結(jié)合能力，進(jìn)而提高了FGBβ基因的轉(zhuǎn)錄水平［15］。

本研究未發(fā)現(xiàn)血漿Fg濃度與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)。此外，雖然FGBβ-148C/T突變型者的血漿Fg濃度明顯高于野生型者，然而同樣是Ⅳ期結(jié)直腸癌，突變型者較野生型者的中位PFS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]可能與樣本量少以及分組時(shí)未排除其他影響因素(治療方案、并發(fā)癥等)有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者較正常人群血漿Fg濃度明顯升高，且FGBβ-148T等位基因及突變基因型頻率也均顯著升高，因此該位點(diǎn)的多態(tài)性可能是導(dǎo)致體內(nèi)Fg濃度改變的原因之一。雖未能證實(shí)FGBβ-148C/T與Ⅳ期患者預(yù)后的相關(guān)性，但突變型組的中位PFS有縮短趨勢(shì)。因此未來需要擴(kuò)大樣本量并嚴(yán)格分組來證實(shí)FGBβ-148C/T多態(tài)性是否有提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后的作用。

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The correlation study of beta-fibrinogen gene polymorphisms and plasma fibrinogen concentration in patients with colorectal cancer

WANG Jingwen, HAN Tao, CHEN Xi, TANG Xi (Department of

Oncology, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China)

TANG Xi E-mail: olivia9tang@126.com

Background and purpose: Patients with colorectal cancer are often accompanied by the increase of plasma fibrinogen concentration. This study aimed to investigate the distribution characteristics of beta-fibrinogen gene -448G/A, -148C/T, -1420G/A and -854G/A polymorphism and plasma fibrinogen (Fg) concentration in patients with colorectal cancer. Furthermore, we analyzed their effects on the occurrence and development of cancer. Methods: The level of plasma Fg was quantified by using Clauss clotting method. FGBβ gene polymorphisms were identified by real-time fluorescence quantitative PCR (RTFQ-PCR) in 194 colorectal cancer patients and 74 healthy controls. Results: The plasma Fg levels in tumor metastasis group and non-metastasis group were significantly higher than that in control group, respectively (P＜0.05). Compared with control group, the frequencies of -148T allele and mutation genotype were notably higher in disease group (P＜0.05). In all the groups, the plasma Fg levels of those with -148T allele were higher than those without -148T allele (P＜0.05). In stage Ⅳ patients, there was no difference in PFS between -148T wild genotype group and mutation genotype group (P＞0.05). Conclusion: Plasma Fg concentration in patients with colorectal cancer was significantly raised, which suggests that Fg may play a role in the occurrence and development of colorectal cancer. The beta-fibrinogen gene -148C/T polymorphism is one of the reasons that cause plasma Fg elevation, but has no correlation with prognosis of patients with stage Ⅳ colorectal cancer.

Fibrinogen; Gene polymorphism; Colorectal cancer

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.10.009

R735.3+5；R735.3+7

A

1007-3639(2015)10-0807-05

2015-06-25

2015-08-25）

上海市衛(wèi)生計(jì)生委員會(huì)科研資助項(xiàng)目(20114209)。

唐 曦 E-mail:olivia9tang@126.com