孫 濤，孫之潭，胡美英，鐘國華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室，廣州 510642)

魚藤，別名毒魚藤，簍藤。為蝶形花科Papilionoideae 魚藤屬Derris 多年生木質(zhì)藤本植物，產(chǎn)于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)。魚藤屬共有70 多種，我國有20 多種，產(chǎn)于西南部經(jīng)中部至東南部(婁予強等，2010)。魚藤屬植物具有抗氧化、抗癌、抗菌、降血糖、鎮(zhèn)痛等功能，在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用(楊巡紜等，2013)。魚藤屬植物根部含有一種重要的活性成分——魚藤酮類化合物，其具有較廣的殺蟲譜，其毒性對農(nóng)作物安全，對哺乳動物低毒，是一種比較理想的植物源農(nóng)藥(張庭英等，2005)。目前魚藤酮主要從魚藤的根中提取，大量提取會造成魚藤植被的破會，生態(tài)環(huán)境的惡化，而人工種植周期長，占用大量土地，組織培養(yǎng)的費用又較高，很難應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實際。因此尋找可替代魚藤的新型生物資源具有極其重要的意義。

植物內(nèi)生真菌是指在其生活史一定階段或全部階段生活在健康植物組織或器官內(nèi)部，而被侵染的宿主植物并不表現(xiàn)出明顯病癥的一類真菌(Stone et al.，2000)。內(nèi)生真菌長期生活在植株體內(nèi)的特殊環(huán)境中并且與其協(xié)同進化，一方面植株為其提供生長必需的能量和營養(yǎng);另一方面內(nèi)生真菌又通過自身的代謝活動或者信號傳導(dǎo)作用對植物體產(chǎn)生影響(Zou et al.，2000;石瑛，2010)?，F(xiàn)代內(nèi)共生理論認(rèn)為，植物與內(nèi)生真菌在長期的協(xié)同進化過程中，生物化學(xué)途徑的連續(xù)演化會導(dǎo)致信息物質(zhì)在內(nèi)生真菌與宿主間的相互傳遞(邵愛娟等，2001)。大量研究表明植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物極為豐富，具有多種生物活性，如殺蟲、抑菌、調(diào)節(jié)植物生長等，其中某些產(chǎn)物與宿主的次級代謝產(chǎn)物相同或相似(楊春平等，2005)。內(nèi)生菌的特殊生境決定了其次級代謝產(chǎn)物的獨特性。研究顯示，51%的從植物內(nèi)生真菌分離的生物活性物質(zhì)是以前沒有發(fā)現(xiàn)的化合物(Strobel，2003)。因此，利用植物內(nèi)生真菌開發(fā)新藥源具有極大的可能性。本文是以毛魚藤Derris elliptica Benth.、白花魚藤 Derris albo-rubra Hemsl.、蜜花魚藤Derris thyrsiflora Benth.3種魚藤屬植物的內(nèi)生真菌為研究對象，從中分離篩選代謝產(chǎn)物對昆蟲具有生物活性的內(nèi)生真菌。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本論文中的魚藤內(nèi)生青霉菌株P(guān)enicillium sp.及其他菌株均為作者從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室殺蟲植物標(biāo)本園內(nèi)的毛魚藤、白花魚藤和蜜花魚藤中分離得到。

1.2 供試?yán)ハx及飼養(yǎng)

家蠶Bombyx mori L.:由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶絲科學(xué)系提供3 齡家蠶幼蟲，在實驗室里(溫度25℃±1℃，相對濕度70%)，把家蠶放在托盤中以桑葉飼養(yǎng)，待長到4 齡供試。

松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus N.:供試松材線蟲分離于廣東省東莞市樟木頭鎮(zhèn)病區(qū)松樹。在25℃±1℃培養(yǎng)箱中以玉米培養(yǎng)盤多毛孢Pestalotia sp.15 d 后，用改良貝曼漏斗法分離線蟲，通過100 目篩后收集于500 目篩，用無菌水沖洗兩次，配成約10000 條/mL 線蟲液備用。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，馬鈴薯200 g;葡萄糖20 g;瓊脂20 g;水1000 mL;pH 自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸2 min，打漿1-2 min，沖洗打漿機，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補足水至1000 mL。

液體培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)。

1.4 內(nèi)生真菌的分離、純化和培養(yǎng)

采用內(nèi)生真菌常用的分離方法:采集新鮮供試植物的根和嫩枝，進行表面消毒。首先分別以自來水和無菌水沖洗3-4 次，然后用75%酒精漂洗(5-15 min)，用無菌水沖洗3-4 次，再置于次氯酸鈉溶液(有效氯體積分?jǐn)?shù)為10%)漂洗1 min，最后用無菌水沖洗4 次。在超凈工作臺上將消毒過的植物組織切割成0.5 cm2×0.5 cm2小片，移入PDA 平板上，于25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。3-5 d 待植物樣品邊緣長出菌絲體后，根據(jù)菌絲體的形態(tài)特點(包括菌絲體的顏色、形狀和質(zhì)地等)，采用尖端菌絲體挑取法對不同菌株進行分離純化。采用組織印跡法檢驗植物組織的滅菌效果:即將消毒而未切割的植物組織與固體平板接觸3-5 min，培養(yǎng)3-5 d，根據(jù)平板上菌落的有無判定分離結(jié)果的有效性(Sturz et al.，1997)。

內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)采用采用搖瓶發(fā)酵法。將純化菌株在無菌條件下接入裝有150 mL PD 培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，將其置于搖床中(25℃-28℃，RH=75%-85%，L∶D=12∶12)培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)120 r/min，培養(yǎng)7-9 d。

1.5 內(nèi)生真菌活性物質(zhì)提取

用100 目篩將菌絲體由發(fā)酵液濾出，置于45℃烘箱中鼓風(fēng)烘干，得干菌絲體。菌絲體中加入10 倍體積(V/W)的甲醇冷浸提取，置于避光暗處，冷浸每次持續(xù)48 h 以上，浸提三次，提取液合并，減壓濃縮得粗提物。

1.6 對家蠶的生物活性測定

采用點滴法:供試樣品用丙酮稀釋，用微量點滴儀將稀釋液點滴于家蠶試蟲的前胸背板，對照組點滴丙酮。4 齡試蟲點滴5μL。處理后加入新鮮的桑葉，分別于24 h、48 h 檢查試蟲的生存和死亡頭數(shù)，按下列公式計算死亡率和校正死亡率。計算公式如下:

Abott 公式:

1.7 對松材線蟲的生物活性測定

采用浸漬生測法:加1.5 mL 無菌水(含5%丙酮V/V)樣品稀釋液于直徑為3 cm 小培養(yǎng)皿中，然后加入供試線蟲30-50 頭，每處理設(shè)3個重復(fù)，另設(shè)5%丙酮溶液為對照。同一處理放入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25℃培養(yǎng)箱中。分別于24 h 和48 h 用針刺法檢查試蟲的生存和死亡個數(shù)，按1.6 的公式計算死亡率和校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛魚藤等魚藤屬植物內(nèi)生真菌的分離和初步鑒定結(jié)果

對毛魚藤、白花魚藤、蜜花魚藤等魚藤屬植物根和莖的內(nèi)生真菌進行了分離，根據(jù)其菌落形態(tài)和孢子、分生孢子梗著生狀態(tài)等，對所分離純化的部分內(nèi)生真菌進行了初步鑒定，初步鑒定結(jié)果見表1。由于部分內(nèi)生真菌在PDA 培養(yǎng)基上不能誘導(dǎo)產(chǎn)孢，難以用經(jīng)典形態(tài)學(xué)的方法進行菌種鑒定，因此未能全部列出。

表1 魚藤屬植物內(nèi)生真菌初步鑒定結(jié)果Table 1 Preliminary identification results of endophytic fungi isolated from the Derris

2.2 內(nèi)生青霉等真菌甲醇提取物對松材線蟲的生物活性

采用浸漬生測法，對魚藤內(nèi)生青霉和另外3 株代謝表現(xiàn)旺盛的炭疽屬、擬莖點霉屬和黃曲霉屬內(nèi)生真菌的菌絲體甲醇提取物進行了生物活性測定，結(jié)果見表2。從表中可以看出，4種內(nèi)生真菌中以青霉菌的代謝產(chǎn)物對松材線蟲的毒殺效果最強，處理24 h 和48 h 后的校正死亡率分別為85.60%和93.24%，與其他內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的生物活性差異顯著。

表2 4種內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對松材線蟲的毒力Table 2 Toxicity of the secondary metabolites of four endophytic fungi against Bursaphelenchus xylophilus N.

2.3 內(nèi)生青霉等真菌甲醇提取物對家蠶的生物活性

采用點法，對內(nèi)生青霉等4種真菌菌絲體甲醇提取物對家蠶4 齡幼蟲的觸殺活性進行測定，結(jié)果見表2，以1.50 mg/頭的劑量點滴處理家蠶4 齡幼蟲時，青霉菌代謝產(chǎn)物對家蠶4 齡幼蟲的觸殺活性最高，24 h 的校正死亡率達(dá)到100%;0.50 mg/頭的劑量對家蠶4 齡幼蟲48 h 和72 h 的校正死亡率分別為50%和95.8%。而另外3種真菌代謝產(chǎn)物對家蠶4 齡幼蟲無觸殺活性。

表3 4種內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對家蠶4 齡幼蟲的觸殺毒力Table 3 Contact toxicity of the secondary metabolites of four endophytic fungi against 4th instar larvae of the silkworm Bombyx mori L.

3 結(jié)論與討論

目前對植物病蟲害的防治多采用農(nóng)藥來進行化學(xué)防治。但農(nóng)藥的不合理使用也帶來了一些弊病，如對害蟲天敵的毒害，對環(huán)境的污染以及導(dǎo)致有害物產(chǎn)生抗藥性等。因此迫切需要開發(fā)對人畜毒副作用小，對環(huán)境友好且藥效持久的農(nóng)藥。據(jù)文獻報道，一些植物內(nèi)生真菌為尋找可替代，毒副作用小，安全有效的綠色農(nóng)藥提供了可能(Benhamou and Nicole，1999)。目前，植物內(nèi)生真菌本身及其次生代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用的研究已經(jīng)去取的較大的進展，一些非常有價值的新菌株和新化合物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)(江愛兵等，2010)。蘭琪等(2004)從苦皮藤植株中分離得到一株具有殺蟲活性的內(nèi)生真菌，其菌絲體的丙酮粗提物對3 齡粘蟲有毒殺作用，在500μg/mL 濃度處理下，24 h 后的死亡率為85.3%。Strobel 等(2004)從植物 Bontia daphnoides 中分離得到內(nèi)生真菌Nodulisporium sp.，該菌會產(chǎn)生一種吲哚二萜類化合物Nodulisporic acids，實驗證明該物質(zhì)具有殺滅大蒼蠅幼蟲的活性。

根據(jù)某些藥用植物的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)的現(xiàn)象，推測殺蟲植物內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的殺蟲活性物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)苦楝的某些內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生楝科植物的活性物質(zhì)——苦楝素(王琪等，2007)，喜樹的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生喜樹堿及其衍生物(潘學(xué)武等，2010;曹晉靜和康冀川，2014)。本研究便是以傳統(tǒng)殺蟲植物毛魚藤、白花魚藤和蜜花魚藤3種魚藤屬植物的內(nèi)生真菌為研究對象，以家蠶和松材線蟲為試蟲，測定魚藤屬植物的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的生物活性。4種內(nèi)生真菌的的代謝產(chǎn)物對松材線蟲都具有一定的毒殺活性，其中青霉菌的代謝產(chǎn)物活性最高，48 h 校正死亡率達(dá)90%以上。4種內(nèi)生真菌中，只有青霉菌的代謝產(chǎn)物對家蠶4 齡幼蟲具有觸殺活性，1.5 mg/頭劑量處理時，24 h 校正死亡率即達(dá)到100%。本文只對內(nèi)生真菌的甲醇初提物進行了生物活性研究，其次生代謝產(chǎn)物的種類以及結(jié)構(gòu)還待進一步鑒定。

References)

Benhamou N，Nicole M.Cell biology of plant immunization against microbial infection:The potential of induced resistance in controlling plant diseases［J］.Plant Physiol.Bioch.，1999，37(10):703-719.

Cao JJ，Kang JC.The Screening of endophytic fungus producing camptothec in Camptotheca cuminata Decne.strains and the research of pharmaceutical chemistry［J］.Hubei Agric.Sci.，2014，53(3):565-568.［曹晉靜，康冀川.喜樹內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹堿菌株的篩選及藥化研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(3):565-568］

Jiang AB，Wang KM，Zhang F，et al.Reserch progress of agro-activation plant endophytic fungi and their secondary metabolites［J］.Hunan Agric.Sci.，2010，8:7-10.［江愛兵，王開梅，張鳳，等.植物內(nèi)生真菌及其次生代謝物的農(nóng)用研究進展［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，8:7-10］

Lan Q，Ji ZQ，Gu AG，et al.Preliminary study on the insecticidical and fungicidical components of endophytic fungus in Celastrus angulatus［J］.Journal of Northwest A ＆ F University(Natural Science Edition)，2004，32(10):79-84.［蘭琪，姬志勤，顧愛國，等.苦皮藤內(nèi)生真菌中殺蟲殺菌活性物質(zhì)的初步研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，32(10):79-84］

Lou YQ，Ye YP，Zhang LH，et al.Advances in the research biological pesticide resource-Derris［J］.Bull.Agric.Sic.Tech.，2010，20(1):108-111.［婁予強，葉燕萍，張林輝，等.生物農(nóng)藥資源—魚藤的研究進展［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，2010，(1):108-111］

Pan XW，Han XH，Yang XL.Recent advances of camptothecin and its analogues produced by endophytic fungi［J］.Journal of Wuhan Bioengineering Institute，2010 6(3):230-234.［潘學(xué)武，董妍玲，石亞亞.內(nèi)生真菌產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的研究進展［J］.武漢生物工程學(xué)院學(xué)報，2010 6(3):230-234］

Shao AJ，Lin SF，Zhang SJ，et al.Isolation of a kind of endophytic fungus which can produce taxol compounds［J］.Acta Academiae Medicinae Sinicae，2001，23(6):642-644.［邵愛娟，林淑芳，張思巨，等.一種能產(chǎn)生紫杉醇類化合物內(nèi)生真菌的分離［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2001，23(6):642-644］

Shi Y.Effects of endophytic fungi on growth and development of plants［J］.Modern Agricultural Science and Technology，2010，6:36-38.［石瑛.內(nèi)生真菌對植物生長發(fā)育的影響［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010，6:36-38］

Stone JK，Bacon CW，White JF，An overview of endophytic microbes:endophytism defined［J］.Microbial Endophytes，2000，3:29-33.

Sturz AV，Christie BR，Matheson BG，et al.Biodiversity of endophytic bacteria which colonize red clover nodules，roots，stems and foliage and their influence on host growth［J］.Biol.Fert.Soils.，1997，25(1):13-19.

Strobel G，Daisy B，Castillo U，et al.Natural products from endophytic microorganisms［J］，J.Nat.Prod.，2004，67(2):257-268，

Strobel GA.Endophytes as sources of bioactive products［J］.Microbes Infect，2013，5(6):535-544.

Wang Q，F(xiàn)u YH，Gao JM，et al.Preliminary isolation and screen of endophytic fungi from Melia azedarach L.［J］.Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica，2007，16(2):224-227.［王琪，傅育紅，高錦明，等.苦楝內(nèi)生真菌的初步分離和篩選［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，16(2):224-227］

Yang XY，Ma RJ，Wang LQ，et al.Advances in research on chemical constituents and pharmacological activities of genus Derris［J］.Nat.Prod.Res.Dev.，2013，25(1):117-128.［楊巡紜，馬瑞婧，王利勤，等.魚藤屬植物的化學(xué)成分及藥理作用研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25(1):117-128］

Yang CP，Chen HB，Wu WJ，et al.Diversity of plant endophytic fungi secondary metabolites and their potential applications［J］.Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica，2005，14(2):126-132，［楊春平，陳華保，吳文君，等.植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性及潛在應(yīng)用價值［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，14(2):126-132］

Zhang TY，Xu HH，Wang CH.Current status of rotenone utilization and existing concerns［J］.Chinese Journal of Pesticides，2005，44(8):352-355.［張庭英，徐漢虹，王長宏.魚藤酮的應(yīng)用現(xiàn)狀及存在問題［J］.農(nóng)藥，2005，44(8):352-355］

Zou WX，Meng JC，Lu H，et al.Metabolites of Colletotrichum gloeosporioides，an endophytic fungus in Artemisia mongolica［J］.J.Nat.Prod.，2000，63(11):1529-1530.