鄭曉杰，林勝利，聶小華，許丹

1(溫州科技職業(yè)學(xué)院(溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院)，浙江溫州，325006)

2(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州，310014)

雞骨架是肉雞加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，約占胴體總重的8%～17%，含有豐富的蛋白質(zhì);但我國(guó)雞骨架資源利用率差，且主要是加工成附加值低的動(dòng)物飼料。近年來開始利用復(fù)合酶水解雞骨架以開發(fā)食品調(diào)味品基料，由于雞骨酶解液普遍存在著風(fēng)味不足的缺點(diǎn)，美拉德反應(yīng)成為了改善其產(chǎn)品整體風(fēng)味的一種有效手段。已有研究表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物肉味強(qiáng)度比傳統(tǒng)的煮雞或烤雞的肉味強(qiáng)80～100倍［1］。

目前雞骨資源的研究多集中于酶解工藝［2-3］和酶解液美拉德反應(yīng)工藝［4-5］等方面，而對(duì)雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味成分等相關(guān)研究較少。本文擬在不同溫度下(60～100℃)進(jìn)行雞骨酶解液-木糖體系的美拉德反應(yīng)，分析其產(chǎn)物性質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

冷凍雞骨架，市售，去除其表層肌肉與脂肪;中性蛋白酶(4.7萬U/g)、木瓜蛋白酶(60萬 U/g)、胰酶(1 400 U/g)，購于河南華森食品配料有限公司。

752型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司;CR22N/CR21N高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司;ISQ單四極桿GC-MS，美國(guó)熱電公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞骨酶解液的制備

稱取一定量的雞骨，按1∶1.5(g∶mL)比例加入水后于130℃高壓蒸煮20 min，勻漿后于50℃和自然pH下進(jìn)行復(fù)合酶酶解，其中復(fù)合酶為中性蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶(1∶2∶1)，酶底比為為2 200 U/g原料;酶解3.5 h后于100℃下處理15 min，冷卻，離心去沉淀，上清液即為雞骨酶解液。

1.2.2 雞骨酶解液的美拉德反應(yīng)

取雞骨酶解液50 mL，加入木糖2.0 g，分別在60、80、100℃溫度下反應(yīng)90 min后，立即用冰水冷卻以終止反應(yīng)，即為雞骨酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3 pH的測(cè)定

采用數(shù)字酸度計(jì)直接測(cè)定。

1.2.4 游離氨基的測(cè)定

采用鄰苯二甲醛法(OPA法)測(cè)定游離氨基的含量［6］。將雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍，取0.1 mL稀釋液與3 mL 0.05 mol/L硼砂緩沖溶液(含0.8 mg/mL OPA，1%SDS，2 μg/mL β-巰基乙醇)混勻，室溫下反應(yīng)3 min，于340 nm下測(cè)定吸光度。以賴氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光值轉(zhuǎn)換為賴氨酸濃度當(dāng)量。

1.2.5 中間產(chǎn)物和褐變程度的測(cè)定

將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，采用紫外可見光分光光度?jì)分別在294 nm和240 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.6 熒光光譜分析

將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍后，采用Spectramax M2多功能酶標(biāo)儀分別在激發(fā)波長(zhǎng)347 nm進(jìn)行發(fā)射波長(zhǎng)掃描(300～600 nm)。

1.2.7 揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析

固相微萃取:選用65 μm PDMS/DVB探頭，老化溫度250℃，老化時(shí)間30 min。樣品瓶于55℃下恒溫萃取40 min，頂空取樣。

色譜條件:色譜柱為TG-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，高純氦氣為載氣，柱流量 1 mL/min。進(jìn)樣口溫度230℃，不分流，進(jìn)樣量1 μL。初始柱溫40℃，保持3 min，以5℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持15 min，流速30 mL/min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度280℃，傳輸線溫度250℃，質(zhì)譜掃描范圍35～500 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物pH值和游離氨基的變化

在美拉德反應(yīng)初期，蛋白質(zhì)、肽類或氨基酸的α-或ε-氨基與還原糖類羰基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，消耗游離氨基;隨著反應(yīng)的進(jìn)行還會(huì)生成甲酸、乙酸和丙酮酸等酸性物質(zhì)，導(dǎo)致反應(yīng)體系pH值進(jìn)一步下降［6］。因此，pH值和游離氨基是衡量美拉德反應(yīng)程度的重要指標(biāo)。

圖1 溫度對(duì)雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物pH和游離氨基的影響Fig.1 Effect of temperature on pH and free amino group of MRPs from chicken bone protein hydrolysate

由圖1可知，雞骨酶解液與木糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，其pH值發(fā)生顯著下降，由起始的6.09分別降至4.77～4.45。郭麗萍等亦在半乳糖-賴氨酸美拉德反應(yīng)模式的研究中發(fā)現(xiàn)，加熱200 min后反應(yīng)體系pH由5.0顯著降至3.6～3.8［7］。雞骨蛋白經(jīng)酶解后可生成氨基酸和小分子肽類，易與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。但各美拉德反應(yīng)產(chǎn)物之間不存在顯著性差異，這主要是因?yàn)槿跛釛l件下美拉德反應(yīng)進(jìn)程緩慢，從而無法體現(xiàn)出不同溫度下雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物pH之間的差異。

雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中游離氨基亦明顯減少，其含量損失隨著加熱溫度的增加而增加，表明游離氨基在較高的溫度下更快地連接到木糖的羰基上。在100℃下雞骨酶解液與木糖的美拉德反應(yīng)比較徹底，游離氨基由起始的388.23 mmol/L降至303.63 mmol/L，損失率為21.79%。實(shí)驗(yàn)中較低的游離氨基損失主要是由于弱酸條件不利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行;Jiang等［8］也報(bào)道了相似結(jié)論，酪蛋白與半乳糖在pH 5～6、95℃下發(fā)生美拉德反應(yīng)2 h，自由氨基損失率較低，約為15%～20%;只有當(dāng)pH ＞9.0時(shí)自由氨基才被大量消耗。

2.2 雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中間產(chǎn)物生成和褐變程度的變化

美拉德反應(yīng)高級(jí)階段，糖類物質(zhì)裂解生成酮、醛類等無色小分子中間產(chǎn)物，該類產(chǎn)物自身或相互間聚合生成類黑精等大分子褐色物質(zhì)，使體系表現(xiàn)出顯著的顏色特征。因此常用中間產(chǎn)物特征吸收A294nm和褐變程度A420nm來檢測(cè)美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度。由圖2可知，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中A294nm和A420nm值均隨著加熱溫度的增加而快速增加，且兩者之間存在一定的正相關(guān)性，說明美拉德反應(yīng)過程中間產(chǎn)物形成的同時(shí)伴隨著其聚合生成褐色物質(zhì)，該結(jié)果與孟艷麗［9］、Guan［10］等的研究相一致。雞骨酶解液與木糖在100℃反應(yīng)90 min后，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A294nm和A420nm分別比對(duì)照組增加了5.76倍和7.35倍。此外，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中間產(chǎn)物生成、褐變程度均與游離氨基的含量損失存在正相關(guān)。

2.3 雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光光譜的變化

美拉德反應(yīng)高級(jí)階段降解形成的小分子物質(zhì)，具有一定的熒光吸收特性，通常被認(rèn)為是褐色物質(zhì)形成的前體物，其熒光強(qiáng)度表征了熒光小分子物質(zhì)的產(chǎn)生狀態(tài)。由圖3可知，雞骨酶解液在發(fā)射波長(zhǎng)345 nm處時(shí)有最大熒光強(qiáng)度，一般認(rèn)為是蛋白質(zhì)Phe、Trp或Tyr殘基的內(nèi)源性熒光;雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在該處的熒光強(qiáng)度隨著加熱溫度的增加而顯著減少，同時(shí)在450 nm附近出現(xiàn)新的熒光吸收峰，符合美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光特征，其熒光強(qiáng)度隨著加熱溫度的增加而逐漸增加，其中100℃時(shí)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度最大。劉平等人在研究二甘肽-木糖美拉德反應(yīng)體系時(shí)亦發(fā)現(xiàn)了347 nm和430 nm兩處熒光吸收峰［11］。此外，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度與中間產(chǎn)物生成(A294nm)存在一定的正相關(guān)，兩者均表明了美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的形成。

圖2 溫度對(duì)雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中間產(chǎn)物生成和褐變程度的影響Fig.2 Effect of temperature on the and browning of MRPs from chicken bone protein hydrolysate

圖3 溫度對(duì)雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光光譜的影響Fig.3 Effect of temperature on fluprescent spectra of MRPs from chicken bone protein hydrolysate

2.4 雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化

由表1可知，雞骨酶解液總共鑒定出21種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中烴類4.90%、醇類30.70%、酚類0.2%、酯類2.70%、醛酮類40.50%等;其與木糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后揮發(fā)性風(fēng)味成分明顯增加，如酮醛酯類化合物種類增多，且出現(xiàn)了酸類和雜環(huán)類化合物，其中噻唑、呋喃和吡嗪等雜環(huán)類化合物對(duì)于肉香風(fēng)味形成起到重要的貢獻(xiàn)。

醇類化合物由于風(fēng)味閾值較高，在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總體風(fēng)味中主要起協(xié)同作用，同時(shí)可作為風(fēng)味前體物質(zhì)參加后期的反應(yīng)。與雞骨酶解液相比，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中鑒定出2-己烯-1-醇和2-乙基-1-己醇，這兩種醇類具有溫和油脂味和花果香，董慶利等在低溫蒸煮香腸中發(fā)現(xiàn)了2-己烯-1-醇［12］，趙景麗則在研究金華火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中分析出2-乙基-1-己醇［13］。此外辛醇和 3，7-二甲基-1，6-辛二烯 3-醇具有清純的花果香，可能影響著產(chǎn)物整體風(fēng)味。

醛酮類化合物主要來源于脂肪的熱氧化降解以及氨基酸的降解。雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中己醛和壬醛明顯減少，可能是加熱過程中轉(zhuǎn)化成羧酸等其他揮發(fā)性成分;而己醛的氣味特征與含量有關(guān)，含量高時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈的脂肪酸敗和腥味，濃度低時(shí)呈現(xiàn)清香的青草氣味［14］，因此己醛含量的降低有利于產(chǎn)品整體風(fēng)味的提高。同時(shí)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中還鑒定出苯甲醛和苯丙醛，其中苯甲醛具有杏仁香和焦糖香，孫紅梅等還認(rèn)為苯甲醛有助于賦予產(chǎn)品脂香風(fēng)味［15］。此外，100℃下雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還鑒定出1-乙基硫代-丙酮、2-庚酮和2-十二烷酮等甲基酮，亦是產(chǎn)物肉香風(fēng)味形成的重要組成物質(zhì)。

酸類化合物可能由醛酮類化合物高溫氧化得到或長(zhǎng)鏈脂肪酸降解生成。雞骨酶解液未鑒定出酸類化合物，而美拉德反應(yīng)后其產(chǎn)物中鑒定出2-己烯基己酸、2-甲基-2-戊烯酸、辛酸、異辛酸、庚酸、壬酸、癸酸和十三酸等有機(jī)酸，多數(shù)酸類化合物具有清甜的水果香氣，被認(rèn)為是有效的風(fēng)味修飾劑。

酯類化合物是羧酸和醇的酯化產(chǎn)物，一般認(rèn)為對(duì)肉香形成沒有特殊貢獻(xiàn)。除鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯外，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中還分別鑒定出羥基十一酸內(nèi)酯、丙位十二內(nèi)酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸甲酯和棕櫚酸異丙酯等，其中前兩者可賦予產(chǎn)品產(chǎn)物清香氣味，而肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸甲酯和棕櫚酸異丙酯等長(zhǎng)鏈脂肪酸酯可能使產(chǎn)品整體風(fēng)味更濃厚和協(xié)調(diào)［16］。

雜環(huán)類化合物是肉香重要特征風(fēng)味物質(zhì)，主要來源于氨基酸和還原糖的美拉德反應(yīng)。趙景麗［12］、王旭［17］等指出，美拉德反應(yīng)過程產(chǎn)生大量的呋喃、吡咯、噻吩、吡啶和噻唑等雜環(huán)類化合物，多數(shù)該類化合物閾值較低，具有強(qiáng)烈的烤肉香、焦香和堅(jiān)果香等風(fēng)味特征。且高溫是形成雜環(huán)化合物的先決條件，由表1可知，加熱溫度越高，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中形成的噻唑、呋喃、吡嗪等雜環(huán)類化合物種類和含量越多，100℃下雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中鑒定出雜環(huán)類化合物有苯并噻唑、3-乙基呋喃、2-氨基-4-甲基噻唑、2，3-二乙基吡嗪、糠醛、2，6-二甲基吡嗪，其中3-乙基呋喃和2，6-二甲基吡嗪相對(duì)含量較高。此外，2-氨基-4-甲基噻唑、2，3-二乙基吡嗪和糠醛作為重要的肉香物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品整體風(fēng)味的形成作用不可忽視。

表1 雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS result of volatile compounds in MRPs from chicken bone protein hydrolysate

續(xù)表1

3 結(jié)論

溫度是影響雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味成分的一種重要因素。隨著溫度的升高，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中pH顯著下降，游離氨基減少;中間產(chǎn)物和褐變程度增加，均與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)性;加熱溫度越高，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味成分明顯增加，且出現(xiàn)了較多的醛酮類、酸類和雜環(huán)類化合物，如苯甲醛、1-乙基硫代-丙酮、2-庚酮、肉豆蔻酸異丙酯、3-乙基呋喃、2-氨基-4-甲基噻唑、2，3-二乙基吡嗪、糠醛和 2，6-二甲基吡嗪等，有利于肉香風(fēng)味形成。

［1］ 肖朝耿，唐宏剛，陳黎洪，等.美拉德反應(yīng)制備天然雞肉風(fēng)味調(diào)料的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24(3):499-502.

［2］ 孫紅梅，王金枝，張春暉，等.應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)優(yōu)化雞骨素美拉德反應(yīng)工藝［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2014，14(6):74-80.

［3］ Lieake B.Protein hydrolysis:the key to meat flavoring systems［J］.Food Reviews Imemational，1994，10(3):287-312.

［4］ 王玉霞，張德權(quán)，饒偉麗，等.雞骨蛋白肽酶解工藝參數(shù)優(yōu)化研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32(10):16-19.

［5］ 張恒，鄔應(yīng)龍.雞骨蛋白酶解過程中的產(chǎn)物性質(zhì)研究及電泳分析［J］.食品科學(xué)，2011，32(5):111-114.

［6］ Brands C M J，Van Boekel M A J S.Kinetics modeling of reactions in heated monosaccharide-casein system［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(23):6 725-6 739.

［7］ JIANG Z，WANG L，CHE H，et al.Effects of temperature and pH on angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity and physicochemical properties of bovine casein peptide in aqueous Maillard reaction system［J］.LWT-Food Science and Technology，2014，59(1):35-42.

［8］ 郭麗萍，王鳳舞，唐娟.半乳糖—L-賴氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33(12):19-23.

［9］ 孟艷麗，曾名湧，張軍寧，等.溫度對(duì)鰱魚肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)特性和抗氧化活性的影響［J］.海洋湖沼通報(bào)，2013(1):69-74.

［10］ GUAN Y，LIN H，HAN Z，et al.Effects of pulsed electric field treatment on a bovine serum albumin-dextran model system，a means of promoting the Maillard reaction［J］.Food Chemistry，2010，123(2):275-280.

［11］ 劉平，邢亞閣，張曉鳴，等.二甘肽木糖美拉德反應(yīng)交聯(lián)特性研究［J］.食品工業(yè)科技，2014(11):66-68.

［12］ 趙景麗.金華火腿風(fēng)味形成過程中游離氨基酸參與的美拉德反應(yīng)研究［J］.鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［13］ 董慶利，郭黎洋，屠康，等.不同亞硝酸鹽添加量的低溫蒸煮香腸的風(fēng)味研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(12)，366-372.

［14］ 唐靜，張迎陽，吳海舟，等.頂空吹掃捕集高溫火氣相色譜質(zhì)譜法分離鑒定強(qiáng)化腿中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2014，3(8):115-120.

［15］ 孫紅梅，李俠，張春暉，等.雞骨素及其酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分比較分析［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32(6):661-667.

［16］ 宋國(guó)新，余應(yīng)新，王林祥.香氣分析技術(shù)與實(shí)例［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

［17］ 王旭，馮濤，莊海寧.氨基酸對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物呈香特性的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)調(diào)味品，2013，38(7):1-6.