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      腫瘤血管抑制劑DX-1002結(jié)構(gòu)的NMR確證

      2015-12-17 00:36:58陳芙蓉張玉霞雍智全徐小平
      中國(guó)測(cè)試 2015年11期
      關(guān)鍵詞:近程碳原子苯環(huán)

      陳芙蓉,寧 欣,張玉霞,李 丹,林 潔,雍智全,徐小平

      (1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院,四川 成都 610041;2.東莞達(dá)信生物技術(shù)有限公司,廣東 東莞 523808)

      0 引 言

      DX-1002 的化學(xué)名為(E)-3-(3″-羥基-4″-甲氧苯基)-2-(3′,4′,5′-三甲氧基苯基)丙烯酸正丁銨鹽,分子式為:C23H31NO7;分子量為 433.21,是 Compretastatin類化合物的新衍生物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

      Compretastatin類化合物是Petti小組等從南非Combretum caffrum樹干中提取分離的具有抗腫瘤活性的二苯乙烯類化合物[1-3]。與傳統(tǒng)的直接作用于癌細(xì)胞靶點(diǎn)的細(xì)胞毒類化療藥不同,Compretastatin類化合物可靶向作用于腫瘤的血管,引起內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的改變,從而阻塞腫瘤微血管,達(dá)到抑制腫瘤的目的[3-9]。目前,同類型的化合物已有CompretastatinA-4P(CA4P)作為前體藥物進(jìn)入臨床II-III期試驗(yàn)[2]。然而,這類化合物最大的缺陷是母體結(jié)構(gòu),即CA4的溶解性極差,雖然經(jīng)磷酸酯化后以二鈉鹽的形式增加了水溶性,但是磷酸鹽的引入不僅可能帶來(lái)一定的不良反應(yīng),而且降解后的母體溶解性同樣低,嚴(yán)重限制了CA4P向其他口服劑型開發(fā)的可能,僅能成為靜脈注射劑。為此,DX-1002在研發(fā)時(shí)著重解決了本類化合物的溶解性問題,以溶解性更好的銨鹽替代了CA4P的前體結(jié)構(gòu),不僅藥理活性更優(yōu)且毒副反應(yīng)更低。由于增加了活性母體的溶解性,使DX-1002化合物適合于制備各種劑型,特別是口服制劑,成為一個(gè)極具開發(fā)價(jià)值的腫瘤血管靶向抑制劑。為了明確本品化學(xué)結(jié)構(gòu),本文擬采用NMR技術(shù)檢測(cè)DX-1002的NMR譜,同時(shí)結(jié)合本品質(zhì)譜和紅外光譜吸收等特征光譜的驗(yàn)證[10],首次解析了本品的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

      圖1 DX-1002的結(jié)構(gòu)圖

      1 儀器與試劑

      1.1 儀 器

      Varian UNITY INOVA型400核磁共振譜儀(美國(guó)瓦里安公司);布魯克道爾頓Bio-TOF Q質(zhì)譜儀(美國(guó)布魯克-道爾頓儀器公司);意大利CARLO ERBA 1106元素分析儀(意大利);Nicolet Impact 410型紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet儀器公司)。

      1.2 試 劑

      氘代水(D2O):NMR專用試劑。

      1.3 樣 品

      DX-1002精制品的批號(hào)為010203,含量≥99.75%(HPLC法),購(gòu)于東莞安好醫(yī)藥科技有限公司。

      2 核磁共振譜

      2.1 核磁共振氫譜(1H-NMR)

      根據(jù)氫譜(見圖2),結(jié)合gCOSY譜,對(duì)樣品DX-1002各個(gè)氫原子的1H譜進(jìn)行歸屬:

      1)在1H-MNR譜中,共有11組峰,從低場(chǎng)到高場(chǎng)積分比為 3∶2∶2∶2∶9∶3∶2∶1∶1∶1∶1,DX-1002 分子結(jié)構(gòu)中的27個(gè)質(zhì)子在圖譜上體現(xiàn),4個(gè)活潑氫被氘代。

      2)δ0.832為一組二重峰,質(zhì)子數(shù)為3,同時(shí)gCOSY譜顯示,該質(zhì)子與b-H質(zhì)子相關(guān),推測(cè)為a-CH3;δ1.329為一組二重峰,質(zhì)子數(shù)為2,gCOSY譜顯示,該質(zhì)子除與a-H質(zhì)子相關(guān)外,還與c-H相關(guān),推測(cè)為b-CH2;δ1.546為一組二重峰,質(zhì)子數(shù)為2,gCOSY譜顯示,該質(zhì)子與b-H質(zhì)子和d-H質(zhì)子相關(guān),推測(cè)為c-CH2;δ2.914為一組二重峰,質(zhì)子數(shù)為2,該質(zhì)子與c-H質(zhì)子相關(guān),推測(cè)為d-CH2。由此,可以推斷這4組質(zhì)子為正丁基上的質(zhì)子。

      3)δ3.593為一組二重峰,質(zhì)子數(shù)為 9,gCOSY 譜顯示,該質(zhì)子與 4″-OCH3和 2′,6′-H 質(zhì)子相關(guān),推測(cè)為 3′,4′,5′-OCH3;δ3.749 為一組二重峰,質(zhì)子數(shù)為 3,gCOSY 譜顯示,該質(zhì)子與 3′,4′,5′-OCH3和 5″-H 質(zhì)子都相關(guān),推測(cè)為4″-OCH3。這兩組甲氧基上的質(zhì)子相互影響,以致在圖譜中出現(xiàn)了一個(gè)又強(qiáng)又復(fù)雜的多峰體系,與DX-1002的化學(xué)結(jié)構(gòu)相符。

      4)δ6.375為一組單峰,此峰尖銳,質(zhì)子數(shù)為 2,gCOSY 譜顯示,該質(zhì)子與 3′,4′,5′-OCH3質(zhì)子和6″-H質(zhì)子相關(guān),推測(cè)為 2′,6′-H,與 DX-1002 的結(jié)構(gòu)相符。

      圖2 DX-1002的1H-NMR譜

      5)δ6.386為一組單峰,質(zhì)子數(shù)為 1,gCOSY 譜顯示,該質(zhì)子與3-H質(zhì)子和6″-H質(zhì)子具有相關(guān)性,推測(cè)為 2″-H。

      6)δ6.462為一組二重峰,質(zhì)子數(shù)為 1,gCOSY 譜顯示該質(zhì)子與 2′,6′-H 質(zhì)子和 5″-H 質(zhì)子相關(guān),推測(cè)為 6″-H。 δ6.499為一組二重峰,質(zhì)子數(shù)為 1,gCOSY譜顯示,該質(zhì)子與4″-OCH3質(zhì)子和6″-H質(zhì)子相關(guān),推測(cè)為 5″-H。δ7.346為一組單峰,質(zhì)子數(shù)為 1,gCOSY譜顯示,該質(zhì)子與2″-H和6″-H相關(guān),推測(cè)為3-H。

      由上述解析綜合可得出DX-1002結(jié)構(gòu)中所有氫原子的歸屬:δ0.832(d,3H,a-CH3),δ1.329(d,2H,b-CH2),δ1.546(d,2H,c-CH2),δ2.914(d,2H,d-CH2),δ3.593(d,9H,3′,4′,5′-OCH3),δ3.749(d,3H,4″-OCH3),δ6.375(s,2H,2′,6′-H),δ6.386(s,1H,2″-H),δ6.462(d,1H,5″-H),δ6.499(d,1H,6″-H),δ7.346(s,1H,3-H);另外還有4個(gè)活潑氫,在圖譜中未能表現(xiàn)出來(lái),在D2O中被D氫取代。該信號(hào)歸屬符合DX-1002的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

      1.2 核磁共振碳譜(13C-NMR)

      1)以重水為溶劑測(cè)得13C-NMR的圖譜(見圖3)中,共有21組峰:其中DEPT圖譜表現(xiàn)出伯碳有4組共5個(gè)碳原子;仲碳有3組共3個(gè)碳原子;叔碳有5組共6個(gè)碳原子;季碳有8組共為9個(gè)碳原子的峰。故樣品中共有23個(gè)碳原子,這與DX-1002的分子式相符。

      2)δ15.103為伯碳峰,且在gHMQC譜上顯示與a-CH3的質(zhì)子近程相關(guān),在gHMBC譜上顯示與b-CH3,c-CH3的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān),故可推定為 a-CH3;δ21.34,δ31.101,δ41.526 均為烷烴仲碳,根據(jù) DX-1002 的結(jié)構(gòu)可推定其分別為 b-CH2,c-CH2,d-CH2。確定這 4 個(gè)碳原子構(gòu)成正丁基(C4H9-)。

      3)δ57.788 為伯碳峰,且與 4′-OCH3上的質(zhì)子近程相關(guān),與4″-OCH3的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān),推測(cè)為4′-OCH3上的伯碳原子;同時(shí)δ58.186為二重峰,表示有兩個(gè)伯碳原子,且與 3′,5′-OCH3的質(zhì)子近程相關(guān),與 4″-OCH3上的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān),推測(cè)為 3′,5′-OCH3的 2 個(gè)伯碳原子;同理,δ63.341為4″-OCH3上的伯碳原子。

      4)δ109.224為叔碳峰,峰高且尖,為二重峰,與芳環(huán)2′,6′-H上的質(zhì)子存在近程相關(guān),與3-H的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān),推定此碳為芳環(huán)2′,6′的二個(gè)叔碳原子。

      5)δ113.626 為叔碳峰,其與 5″-H 位上的質(zhì)子近程相關(guān),與6′-H上的質(zhì)子具有遠(yuǎn)程相關(guān)性,推定為5″-C。

      6)δ118.900為叔碳峰,與2″-H的質(zhì)子近程相關(guān),與3-H和6′-H的質(zhì)子具有遠(yuǎn)程相關(guān)性,推定為2″-C。

      7)δ125.518為叔碳峰,與6″-H的質(zhì)子近程相關(guān),與5″-H的質(zhì)子存在著遠(yuǎn)程相關(guān)性,推定其為6″-C。

      8)δ130.918 為季碳峰,只與 2″,6″-H 的質(zhì)子存在著遠(yuǎn)程相關(guān)性,推定其為1″-C。

      9)δ137.718為叔碳峰,與3-H的質(zhì)子有近程相關(guān);δ137.812為季碳峰,只有與3-H的質(zhì)子存在遠(yuǎn)程相關(guān),推測(cè)為C=C上的兩個(gè)碳原子,即3,2-C。

      10)δ138.175為季碳峰,其與多組質(zhì)子峰存在著遠(yuǎn)程相關(guān)性,故推定為1′-C。

      11)δ139.29 為季碳峰,只與 4′-OCH3上的質(zhì)子存在遠(yuǎn)程相關(guān)性,推測(cè)為4′-C。

      12)δ146.588 為季碳峰,只與 2″-H 的質(zhì)子有遠(yuǎn)程相關(guān)性,推測(cè)為 3″-C。

      13)δ149.858 為季碳峰,只與 5″-H 的質(zhì)子有遠(yuǎn)程相關(guān)性,推測(cè)為 4″-C。

      14)δ154.930為季碳雙峰,符合這一特性的只有苯環(huán)上的 3′,5′-C。

      圖3 DX-1002的13C-NMR譜

      15)δ178.099為季碳峰,沒有近程相關(guān)的氫,只與3-H質(zhì)子具有遠(yuǎn)程相關(guān)性,推測(cè)為1-C。

      綜上所述,13C譜的信號(hào)歸屬如下:

      δ15.103(a-CH3),δ21.34(b-CH2),δ31.101(c-CH2),δ41.526(d-CH2),δ57.788(4′-OCH3),δ58.186(3′,5′-OCH3),δ63.341(4″-OCH3),δ109.224(2′,6′-C),δ113.626(5″-C),δ118.900(2″-C),δ125.518(6″-C),δ130.918(1″-C),δ137.718(3-C),δ137.812(2-C),δ138.175(1′-C),δ139.29(4′-C),δ146.588(3″-C),δ149.858(4″-C),δ154.930(3′,5′-C),δ178.099(1-C)。

      1.3 順反異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的鑒定

      根據(jù)本品1H譜、gCOSY、gHQMC和NOESY譜的數(shù)據(jù)比較和解析,對(duì)分子中順反異構(gòu)進(jìn)行了判斷。

      1)在 gCOSY 譜中可以看到 2′,6′-H 與 6″-H 也具有相關(guān)性,證明了 2′,6′-H 與 6″-H 在空間位置上是相接近的,即 2′,6′-H 所在的苯環(huán)與 6″-H 所在的苯環(huán)在烯烴雙鍵的同側(cè)。

      2)由gHMQC譜可知,1-C與3-H具有遠(yuǎn)程相關(guān)性,說(shuō)明1-C和3-H在烯鍵的同側(cè)。

      3)由 NOESY 譜中可看出,3-H 與 2″-H 和 6″-H具有相關(guān)性,說(shuō)明3-H與2″-H和6″-H在空間位置上很接近,即3-H與2″-H和6″-H所在的苯環(huán)連在同一個(gè)烯烴碳原子上。

      1)2)3 )的譜圖結(jié)果顯示本結(jié)構(gòu)中的烯鍵符合反式烯烴(E)的結(jié)構(gòu)特征。

      由以上的NMR數(shù)據(jù)可知,本品與DX-1002的化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。

      2 元素分析

      元素分析的結(jié)果表明本品H為7.13%,C為60.80%,N為2.86%,與分子式C23H31NO7理論值(C:63.76%,H:7.21%,N:3.23%)相符合。

      3 質(zhì)譜(ESI-MS)

      ESI+質(zhì)譜的質(zhì)荷比434.16與本品的分子離子峰[M+H]相符;質(zhì)荷比 361.12 與其[M-NH2(C4H9)+H]的碎片離子相符;質(zhì)荷比 794.28 為[2M-NH2(C4H9)+H]的碎片峰,質(zhì)荷比 776.31 為[2M-NH2(C4H9)-OH+H]的碎片峰,由此進(jìn)一步證明本品分子式為C23H31NO7,分子量為433.21,化學(xué)結(jié)構(gòu)與圖1的化學(xué)結(jié)構(gòu)的一致性。

      4 紅外吸收光譜(IR)

      紅外吸收光譜的特征吸收3 516.47,3 384.46,1580.01,1552.05cm-1體現(xiàn)出分子中的胺基的存在,2960.07,2847.16cm-1為甲基,2938.54,2839.19cm-1為亞甲基;3167.50,3066.01cm-1為甲氧基,1233.63,1124.66 cm-1為苯環(huán)C-O-C,說(shuō)明本品中有-OCH3連接在苯環(huán)上;1 632.45,1 508.69 cm-1為-C=C-,972.56 cm-1為乙烯基中=CH,904.85,872.63cm-1為苯環(huán)上的=CH,說(shuō)明本品結(jié)構(gòu)中有-C=CH和苯環(huán);1459.37,1355.95cm-1為羧C=O,說(shuō)明結(jié)構(gòu)中有-COOH。由此,證明本品的結(jié)構(gòu)中存在了-NH2,-CH3,-CH2CH3,-OCH3,苯環(huán),CH=CH,C=O等基團(tuán)。

      5 結(jié)束語(yǔ)

      綜上所訴,根據(jù)DX-1002的NMR譜結(jié)果,同時(shí)結(jié)合DX-1002質(zhì)譜碎片特征、IR光譜特征和元素分析,證明 DX-1002 的化學(xué)結(jié)構(gòu)為(E)-3-(3″-羥基-4″-甲氧苯基)-2-(3′,4′,5′-三甲氧基苯基) 丙烯酸正丁銨鹽,分子式為C23H31NO7,分子量為433.21。

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