朱蘇琴 張志剛＊ 葉葆衡 黃印堯,2 李國平,3

（1.廈門銀祥集團(tuán)有限公司肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門 361100；2.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建廈門 361012；3.福建農(nóng)林大學(xué) 福州 350002）

黃曲霉毒素（Af1atoxin，AFT）主要為真菌黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）產(chǎn)生的次級代謝物，主要的生物學(xué)效應(yīng)是致癌、致畸及致突變作用。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1等10多種，彼此結(jié)構(gòu)十分相似，都含有一個(gè)決定毒性的雙呋喃環(huán)和一個(gè)與致癌有關(guān)的氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀渲蠥FB1毒性最強(qiáng)，其毒性為砒霜的68倍，氰化鉀的10倍，已被聯(lián)合國列為一類致癌物[1-2]。高劑量時(shí)可導(dǎo)致急性死亡，低水平持續(xù)性攝入可產(chǎn)生慢性毒性。目前，世界上有1/4的糧食被霉菌毒素污染，其中黃曲霉毒素污染最為嚴(yán)重[3]，黃曲霉毒素污染已成為全球性的難題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國黃曲霉毒素污染率達(dá)90%，其中15%～25%已達(dá)到重度污染而禁用，尤其是在氣候溫濕的南方地區(qū)污染尤為嚴(yán)重，不僅給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失，更為嚴(yán)重的是，殘留在動(dòng)物組織中的AFT可通過食物鏈進(jìn)入人體并富集，最終誘發(fā)肝癌、腎癌、胃癌等，嚴(yán)重威脅人類健康。為此，自1960年發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素以來，各國紛紛制定了黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，我國飼料中黃曲霉毒素（AFB1）限量標(biāo)準(zhǔn)不超過20 ug/kg，豬肉組織中AFB1不超過5 ug/kg，而歐盟制定的標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，即豬肉組織中AFB1不超過2 ug/kg。

已有較多的研究報(bào)道了食品、飼料、花生、玉米、牛乳等黃曲霉毒素污染水平[4-7]，而直接研究動(dòng)物臟器及肌肉組織內(nèi)富集AFB1水平的報(bào)道極少，史瑩華等[8]利用免疫親和柱凈化結(jié)合高效液相色譜法測定了組織樣品中的黃曲霉毒素。本研究以氣候相對潮濕的閩南地區(qū)為背景，以飼喂的食源性動(dòng)物豬、雞、鴨肝臟及肌肉組織為材料，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)測定樣品中的AFB1含量。一方面直接調(diào)查評估閩南地區(qū)食源性動(dòng)物組織中AFB1的殘留量，間接反映了閩南地區(qū)食源性動(dòng)物飼料中AFB1的污染程度，為領(lǐng)導(dǎo)部門規(guī)范養(yǎng)殖業(yè)提供理論依據(jù)；除此之外，本研究還檢測了國外進(jìn)口豬肉中AFB1含量。

1 材料與方法

1.1 材料 檢測的食源性動(dòng)物組織樣本均采集于閩南地區(qū)廈門、漳州、泉州各畜禽養(yǎng)殖場和肉品市場，雞肝臟、鴨肝臟、豬肝臟各40份，本地土種豬肉，白毛豬肉各40份；從英國、丹麥、西班牙、加拿大進(jìn)口豬肉各10份，共40份（由廈門出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供）。

1.2 方法 采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)進(jìn)行檢測，樣品的前處理與檢測方法按照試劑盒（購于美國bioo scientific）進(jìn)行，檢測限為 0.05 ug/kg。

1.2.1 樣品制備 肝臟樣品制備（稀釋倍數(shù)：4倍）：取適量樣品研磨混勻后稱取2 g于50 mL離心管中，加入6 mL乙腈和2.5 mL樣品平衡液，渦旋振蕩10 min，加入200 uL肝臟提取液，渦旋振蕩1 min，4 000 g離心10 min。取600 uL上清液到干凈離心管中，60～70℃氮?dú)獯蹈蓸悠?，?00 uL的35%甲醇/PBS溶解干燥樣品，渦旋混勻1 min，取50 uL作ELISA檢測用。

肌肉樣品制備（稀釋倍數(shù)：10倍）：取適量樣品研磨混勻后稱取5 g于50 mL離心管中，加入25 mL 70%甲醇，搖床振蕩20 min，于4 000 g室溫離心10 min。取上清液以1:1的比例和PBS混合，取50 uL作ELISA檢測用。

1.2.2 ELISA檢測 分別加入50 uL不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品于微孔板中，加入100 uL AFB1抗體，輕輕混勻1 min，室溫下孵育30 min，加入250 uL Wash so1ution洗板3次，洗完后將酶標(biāo)板于紙上輕拍至干，加入150 uL HRP酶標(biāo)抗體，輕輕混勻1 min，室溫下孵育30 min，加入250 uLWash so1ution洗板3次，洗完后將酶標(biāo)板于紙上輕拍至干，加入100 uL TMB，輕輕混勻1 min，室溫下孵育15 min后立即加入100 uL終止液，置于酶標(biāo)儀于450 nm波長測量OD值。

1.3 數(shù)據(jù)分析 計(jì)算每個(gè)濃度標(biāo)樣或樣品在450 nm處的平均吸光度值和空白 （標(biāo)樣AFB1濃度為0 ng/mL）在450 nm處的平均吸光度值，然后計(jì)算出每個(gè)濃度標(biāo)樣或樣品所對應(yīng)的AFB1（固相）與抗AFB1抗體的最大結(jié)合率（%）。

以最大結(jié)合率為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中AFB1含量可根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±Sd）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以AFB1標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，最大結(jié)合率為縱坐標(biāo)制得AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），曲線方程公式為 Y=198.0X2-265.4X+95.09（R2=0.991），待檢樣的AFB1濃度值可根據(jù)所測的OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程公式得出對應(yīng)的濃度值。

圖1 AFB1的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同動(dòng)物肝臟組織中AFB1檢測 不同動(dòng)物組織中黃曲霉毒素B1的檢測水平見表1。由表1可知，雞、鴨、豬3種動(dòng)物肝臟中AFB1的檢出率分別為65%、75%、100%，超標(biāo)率均為0%；平均含量分別為 （0.302 ± 0.034）ug/kg、 （0.289 ± 0.022）ug/kg、（1.498± 0.274）ug/kg。SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，豬肝臟中AFB1含量最高，顯著高于雞、鴨肝臟中 AFB1 含量（P＜0.01）；雞、鴨肝臟中 AFB1 含量相對較低，且二者之間無顯著性差異（P＞0.05）。

以上檢測結(jié)果說明，飼喂的食源性動(dòng)物組織中AFB1含量雖未超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)，但具有超高的檢出率，均為AFB1污染。且飼喂時(shí)間較長的豬肝臟組織內(nèi)的AFB1含量極顯著高于飼喂時(shí)間較短的雞鴨肝臟中 AFB1含量（P＜0.01）；這可能是由于 AFB1在動(dòng)物體內(nèi)的存在是一個(gè)富集的過程，因此，殘留量與動(dòng)物飼喂AFB1污染的飼料的時(shí)間成正比，雞鴨的平均飼喂時(shí)間為90 d左右，而豬為180 d左右，這就不難理解豬肝臟內(nèi)的AFB1殘留量顯著高于雞鴨肝臟。這在一定程度上也說明了動(dòng)物采食AFB1污染的飼料時(shí)間越長，AFB1在體內(nèi)殘留就越多，而且在肝臟中殘留比肌肉多。

2.3 豬肌肉組織中AFB1檢測水平 豬肌肉中AFB1檢測水平見表2。由表2可知，中國與國外進(jìn)口的豬肌肉中黃曲霉毒素B1的檢出率均為100%，超標(biāo)率均為0%。中國土豬、中國菜豬，進(jìn)口豬瘦肉中AFB1的平均含量依次為 （0.811±0.497）μg/kg、（0.863 ± 0.261）μg/kg、（0.912 ± 0.051）μg/kg。 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，國外豬肌肉中AFB1含量雖略高于國內(nèi)，但均無顯著性差異（P＞0.05），且都低于表1中豬肝臟內(nèi)AFB1含量，表明豬肝臟內(nèi)AFB1含量高于其他組織。這與楊其名[9]報(bào)道的泔水豬肝臟中AFB1含量最高，腎臟次之，瘦肉最低結(jié)果一致。以上檢測結(jié)果說明，國內(nèi)外飼料喂養(yǎng)型豬肌肉組織中AFB1含量雖未超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)，但檢出率均為100%。含量顯著高于健康人。許菊萍等[14]研究表明當(dāng)AFB1濃度達(dá)到1.0 g/mL時(shí)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖活動(dòng)。有研究報(bào)道AFT可顯著降低豬的生長性能、顯著降低肝內(nèi)酶活性而導(dǎo)致肝功能嚴(yán)重?fù)p傷[15]，AFB1可通過食物鏈富集于人體，其攻擊的靶器官為肝臟，即使是微量的AFB1，若長期攝入，也具有慢性毒性，最終將導(dǎo)致癌癥尤其是肝癌的發(fā)生。可以想象動(dòng)物或人類長期大量攝入受AFB1污染的飼料或食物，后果

表1 不同動(dòng)物肝臟組織中AFB1檢測水平

表2 豬肌肉組織中AFB1檢測水平

3 小結(jié)與討論

1）應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)對閩南地區(qū)食源性動(dòng)物（雞、鴨、豬）肝臟和肌肉組織以及國外進(jìn)口豬肉中的黃曲霉毒素B1殘留量進(jìn)行抽樣檢測。結(jié)果顯示所有檢測樣品中黃曲霉毒素B1均具有很高的檢出率，其中豬肉、豬肝均為100%、雞肝65%、鴨肝75%，但都低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)；豬肝臟中AFB1含量最高，顯著高于豬肌肉和雞、鴨肝臟中AFB1含量（P<0.01）；而雞、鴨肝臟中的AFB1含量無顯著性差異（P>0.05）；此外，國外進(jìn)口豬肉樣品中AFB1檢出率100%，但未超標(biāo)；Chiavaro[10]報(bào)道了源于意大利北部各農(nóng)場的50份豬肝臟樣本AFB1和AFM1的檢測結(jié)果，所有樣本AFB1含量均低于1.0μg/kg，而本研究結(jié)果顯示豬肝臟AFB1平均含量為1.498±0.274 μg/kg，在一定程度上說明了我國豬肝臟內(nèi)AFB1污染較國外更為嚴(yán)重，須給予重視。檢測結(jié)果表明，食源性動(dòng)物組織中黃曲霉毒素B1殘留普遍存在。

2）黃曲霉毒素，尤其是黃曲霉毒素B1對人類健康的危害極大。研究表明，肝癌的發(fā)生與黃曲霉毒素污染密切相關(guān)，在已明確的肝癌致癌因素中，AFB1、HBV和HCV位居前3位[11]，尤以AFB1為著。流行病學(xué)調(diào)查顯示，AFB1高污染地區(qū)肝癌的發(fā)病率明顯高于低污染地區(qū)[12]，周元平等[13]以肝癌患者的肝組織為研究材料，結(jié)果表明肝癌患者肝組織中AFB1將不堪設(shè)想。

3）飼料為導(dǎo)致豬肉組織中黃曲霉毒素超標(biāo)的極為重要的來源。我國飼料中黃曲霉毒素污染問題普遍存在，田西學(xué)等[16]報(bào)道了陜南關(guān)中地區(qū)飼料黃曲霉毒素B1檢出率72.37%，超標(biāo)率4%。王若軍等[17]從福建、廣東、內(nèi)蒙古、北京、遼寧、湖南、浙江等地采集動(dòng)物、植物蛋白飼料、青貯飼料、菌體蛋白飼料、玉米等進(jìn)行黃曲霉毒素普查，結(jié)果表明黃曲霉毒素污染雖不嚴(yán)重超標(biāo)，但普遍存在。業(yè)內(nèi)人士都很清楚，飼養(yǎng)霉變飼料的家禽家畜，常常出現(xiàn)家禽曲霉菌病害，保育舍小豬、中豬出現(xiàn)陰戶腫脹的假發(fā)情癥狀等，還會導(dǎo)致呼吸與消化系統(tǒng)的疾病，機(jī)體免疫力下降，生長緩慢。

4）要去除食源性動(dòng)物組織中AFB1殘留問題，首先要解決飼料霉變這個(gè)全球性問題。近年來，霉菌毒素脫毒處理技術(shù)成為研究熱點(diǎn)，主要有物理、化學(xué)、生物方法，可以使霉菌毒素不同程度去除或者失活，物理、化學(xué)脫毒法存在“二次污染”問題，而生物脫毒法成為一種更為安全有效的去除黃曲霉毒素的方法，如黃曲霉毒素解毒酶、乳酸菌、葡甘露聚糖等[18-20]都能在一定程度上起到解毒的作用，但至今還沒有一種較為理想、經(jīng)濟(jì)、有效的好方法。面對飼料霉菌污染問題，首先要加強(qiáng)飼料防霉的防范意識，在飼料原料管理、儲存、運(yùn)輸加工等環(huán)節(jié)必須嚴(yán)格把關(guān)，做好防霉措施。從源頭上預(yù)防霉菌的侵害，這是當(dāng)前最有效的防治方法。

[1]Mishra H N,Chitrangada D.A review on biological control and metabolism of aflatoxin [J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2003,43:245-264.

[2]Smela M E,Currier SS,Bailey E A,et al.The chemistry and biology of aflatoxin B1:from mutational spectrometry to carcinogenesis[J].Carcinogenesis,2001,22:535-545.

[3]Moss M O.Risk assessment for aflatoxins in foodstuffs[J].International Biodeterioration and Biodegradation,2002,50:137-142.

[4]林建忠,鄒偉,張志剛,等.LC/MS/MS測定食品中黃曲霉毒素B1的研究[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2004,14（增刊1）:31-33.

[5]楊靜,哈益明,王鋒.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測花生中的黃曲霉毒素B1[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2009,28（6）:35-38.

[6]吳雙明,張海華.乳與乳制品中黃曲霉毒素檢測的研究[J].中國乳業(yè),2012（120）:59-62.

[7]陳欠林,杜妮,萬冬蓮.2012年1-6月全國飼料及原料霉菌毒素調(diào)查報(bào)告[J].豬業(yè)科學(xué),2012（8）:66-67.

[8]史瑩華,許梓榮,馮建蕾,等.高效液相色譜法測定動(dòng)物組織樣品中黃曲霉毒素的殘留量 [J].分析化學(xué),2005,33（6）:850-852.

[9]楊其名.泔水豬肝臟、腎臟和瘦肉中黃曲霉毒素B1、M1含量的檢測[D]甘肅：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2004:1-50.

[10] Chiavaro,Cristina Cacchioli,Elettran Berni,et al.Immunoaffinity clean-up and direct fluorescence measurement of aflatoxins B1and M1 in pig liver:Comparison with high-performance liquid chromatography determination[J].Food Additives and Contaminants,2007,22（11）:1154-1161.

[11]Campbell T C,Chen J,Lin C,et al.Nonassociation of aflatoxin with primary liver cancer in a cross-sectional ecological survey in the People's Republic of China[J].Cancer Res,1990,50:6882.

[12]肖開銀,彭民浩.原發(fā)性肝癌流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2000,7（4）:272-274.

[13]周元平,彭文偉,姚集魯,等.人肝癌組織中黃曲霉毒素和肝炎病毒基因檢測分析 [J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1996,17（1）:20-23.

[14]許菊萍,趙永福,張永軍,等.黃曲霉毒素B1對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的作用研究 [J].醫(yī)藥論壇雜志,2009,30（20）:4-7.

[15]史瑩華,防麗玉,孫宇,等.黃曲霉毒素對豬生長性能及肝臟功能的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,35（6）:55-60.

[16]田西學(xué),李勝,李宏,等.陜南關(guān)中地區(qū)飼料霉菌毒素污染調(diào)查與風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2014,33（1）:75-78.

[17]王若軍,苗朝華,張振雄,等.中國飼料及飼料原料受霉菌毒素污染的調(diào)查報(bào)告[J].飼料工業(yè),2003,24（7）;53-54.

[18]曹紅,伊遜慧,陳善林,等.黃曲霉毒素解毒酶對嶺南黃肉仔雞日糧中黃曲霉毒素B1解毒效果的研究[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22（2）:424-430.

[19]Nagendra S,Wu X R.Aflatoxin B1 binding abilities of probiotic bacteria [J].Bioscience Microflora,1999,18（1）:43-48.

[20]侯然然,謝鵬,張敏紅,等.葡甘露聚糖對飼喂黃曲霉毒素B1日糧的肉仔雞肝生化指標(biāo)和組織的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2008,20（2）:152-157.