熱療通過上調(diào)基因PUMA 表達(dá)誘導(dǎo)胃癌MKN45凋亡

劉 星 肖 鳳 劉 彬

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院重點實驗室，江西，343009）

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一。胃癌的治療，尤其是已失去手術(shù)機(jī)會的晚期胃癌的治療一直是臨床工作的難題。腫瘤熱療是一種以非電離輻射方式作用于腫瘤的物理治療方法，其最大優(yōu)勢在于較少受限于其毒副作用，并能夠多次重復(fù)使用，且可以增強(qiáng)放射治療和化學(xué)藥物治療的效果，目前在腫瘤綜合治療中被受關(guān)注［1］。熱療作為一種新的腫瘤治療方法［2］，不用開刀，無副作用，被譽(yù)為治療腫瘤的“綠色療法”，其治療胃癌漿膜浸潤與腹膜轉(zhuǎn)移有一定療效，但關(guān)于其對不同分化程度胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制，尤其是熱療如何誘導(dǎo)不同分化程度胃癌細(xì)胞凋亡以及凋亡調(diào)控基因在熱療過程中如何表達(dá)等方面仍知之甚少。組織和細(xì)胞發(fā)生癌變總是從構(gòu)成它們的分子開始［3］，但其發(fā)生機(jī)制目前仍未完全闡述清楚。為此，本研究通過熱療（43℃）處理胃癌MKN45細(xì)胞后，應(yīng)用MMT檢測MKN45細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和AO／EB熒光雙染色觀察胃癌細(xì)胞的凋亡情況，并采用免疫印跡方法評價了熱療對胃癌細(xì)胞促凋亡蛋白PUMA表達(dá)的影響。

材料和方法

1.材料

人胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞由江西省消化系疾病研究所饋贈。0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)液 （美國GIBCO公司）。DMSO（美國Amresco公司）。胎牛血清（杭州四季青公司）。四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Amresco公司）。BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司）。ECL發(fā)光試劑盒（美國Thermo公司）。抗熒光淬滅封片液（南京碧云天試劑公司）。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 （Annexin V－FITC／PI）、細(xì)胞凋亡吖啶橙檢測試劑盒（KGA213）及細(xì)胞凋亡EB檢測試劑盒（KGA216）均購置南京凱基公司。鼠抗Actin單抗、Puma單抗、甲叉雙丙烯胺、過硫酸胺（APS）及TEMED（四甲基乙二胺）均購置美國Sigma公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)（37℃、5%CO2飽和濕度），取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行加熱處理。

3.加熱實驗

對照組37℃，常規(guī)培養(yǎng)，不給予加熱處理。實驗組加熱溫度設(shè)置43℃，加熱時間分別為0.5h、1 h、2h及3h，根據(jù)加熱時間不同分為43℃0.5h、1 h、2h及3h等亞組。將處于對數(shù)生長期內(nèi)的SGC7901細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸混勻，計數(shù)后，接種于35mm NEST培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)至貼壁。用封口膜封口后放入43℃的電熱恒溫水浴箱加熱（溫度波動＜士0.1℃）。確保整瓶細(xì)胞平放淹沒于水中，將熱療處理后的細(xì)胞換新鮮的10%FBS－高糖DMEM 培養(yǎng)液，并放置37℃、5%CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)24h。

4.MTT法

非熱療處理組作為常溫對照，同時設(shè)不加細(xì)胞的背景對照。取熱療處理后培養(yǎng)24h的各組細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化。然后用0.25%的胰蛋白酶消化離心，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞計數(shù)，稀釋成1×104／ml，按每孔200μl接種到96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個復(fù)孔。再將每孔加入MTT溶液20μl，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔的光密度（OD）值，波長為570nm。細(xì)胞增殖抑制率＝［1－實驗組OD值／對照組OD值］×100%.

5.透射電鏡

各組細(xì)胞熱處理后于37℃、5%CO2恒溫孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用0.25%胰蛋白酶消化并收取細(xì)胞，1000r／min，離心3min，棄上清后，經(jīng)3.5%戊二醛、1%鋨酸雙固定，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后檸檬酸鉛、醋酸鈾雙染色，透射電鏡觀察及拍照。

6.AO／EB熒光雙染色

熱療處理后培養(yǎng)24h的各組細(xì)胞，用4%多聚甲醛室溫固定10min，加入AO和EB混合溶液染色，避光風(fēng)干，用抗熒光淬滅封片液封片。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及胞核的變化并拍照。細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞／細(xì)胞總數(shù)×%。細(xì)胞壞死率＝壞死細(xì)胞／細(xì)胞總數(shù)×%。

7.Annexin－V和PI雙染色法

收集前述熱療處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h的MKN45細(xì)胞置于10ml離心管中，各樣本的細(xì)胞密度為5×105，1000r／min離心5min后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，室溫下避光孵育15min，1000r／min離心5 min沉淀細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入Annexin V－FITC／PI溶液5μL，4℃下孵育20min，染色后1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

8.Western blot

將熱療處理后的各組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS液洗2次，吸棄PBS液，加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑，輕輕搖動5min后，用一預(yù)冷的橡膠和塑料細(xì)胞刮刮下培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到離心管中，冰浴15min進(jìn)行裂解。裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14000r／min離心15min，吸棄上清液。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。50μg總蛋白質(zhì)在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，膜在5%BSA溶液中室溫培養(yǎng)1h，以封閉膜上的非特異結(jié)合。封閉過的膜加入一抗4℃過夜。TBST洗膜3次，每次5min。再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min。同樣方法標(biāo)記鼠單克隆抗β－actin作對照。洗膜稍干后，按1∶1加入AB顯影液（與二抗HRP結(jié)合），在Bio－Rad的化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影，然后分析灰度值，再計算灰度系數(shù)比。

9.統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示（）.以單因素方差分析（oneway ANOVE）計算多組間差異，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.熱療對胃癌細(xì)胞增殖的影響（圖1）

MTT結(jié)果顯示：熱療后，MKN45細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，至3h最高，熱療處理0.5h、1h、2h、3h后MKN45細(xì)胞增殖抑制率分別為（23.0±1.7）%、（18.7±1.8）%、（33.8±1.6）%、（39.9±2.1）%。提示熱療可有效殺傷胃癌細(xì)胞。但是，MKN45細(xì)胞熱療1h，其細(xì)胞增殖抑制率相對0.5h略有恢復(fù)，這提示MKN45細(xì)胞自身對熱療會產(chǎn)生一定的應(yīng)激能力。

圖1 熱療對MKN45細(xì)胞增殖的影響Fig.1Effects of hyperthermia on proliferation of MKN45cells

2.熱療后胃癌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變（圖2）

倒置顯微鏡觀察：與對照組相比，熱療0.5h部分貼壁MKN45細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞逐漸變圓，核膜皺縮，細(xì)胞內(nèi)顆粒成分逐漸增多，1h相對較少，2h細(xì)胞皺縮、變圓、漂浮細(xì)胞明顯增多，3h細(xì)胞數(shù)目減少，部分細(xì)胞出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象。提示熱療0.5h、2h和3h可明顯殺傷胃癌MKN45細(xì)胞。

圖2 熱療不同時間后MKN45細(xì)胞形態(tài)的變化Fig.2Morphological change of MKN45cells in the various time hyperthermia group

3.AO／EB熒光雙染色觀察細(xì)胞凋亡情況（圖3）

對照組（熱療0h）MKN45細(xì)胞絕大數(shù)呈均勻綠色熒光，個別細(xì)胞質(zhì)淡黃色，而實驗組（熱療0.5 h、1h、2h和3h）MKN45細(xì)胞出現(xiàn)塊狀熒光、桔黃色熒光或濃染的紅色碎片。熱療0.5h，較多MKN45細(xì)胞質(zhì)淡黃色、細(xì)胞核見橘紅色凋亡小體。熱療2h，細(xì)胞膜不完整比率增加，細(xì)胞核呈現(xiàn)致密斑狀現(xiàn)象，細(xì)胞核見橘紅或紅色 “逗點”狀凋亡小體。熱療3h，較多MKN45細(xì)胞體積增大，呈不均勻的橙紅色。熱療0.5h、1h、2h和3h后MKN45細(xì)胞凋亡率都高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。熱療1h后MKN45細(xì)胞凋亡率都低于熱療0.5h、2h、3h后 MKN45細(xì)胞凋亡率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 采用AO／EB雙熒光標(biāo)記的MKN45細(xì)胞凋亡Fig.3Apoptosis of MKN45cells by AO／EB double fluorescent labeling

4.Annexin－V和PI雙染色法流式檢測熱療對細(xì)胞凋亡率的影響（圖4）

通過AO／EB熒光雙染色結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)熱療可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且熱療1h殺傷胃癌細(xì)胞低于0.5h。為了進(jìn)一步證實這一現(xiàn)象，我們通過Annexin－V和PI雙染色法流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。熱療0.5h、1h、2h和3h后MKN45細(xì)胞凋亡率都高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。熱療1h后MKN45細(xì)胞凋亡率都低于熱療0.5h、2h、3h后MKN45細(xì)胞凋亡率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩種凋亡實驗結(jié)果基本吻合。

圖4 在不同熱療時間的MKN45細(xì)胞凋亡Fig.4Apoptosis of MKN45cells in various time by hyperthermia

5.熱療后胃癌MKN45細(xì)胞PUMA蛋白表達(dá)變化（圖5）

與對照組比較，MKN45細(xì)胞各熱療時間組PUMA蛋白表達(dá)明顯升高，熱療0.5h組開始升高，熱療2h組達(dá)最高峰，1h組略低于0.5h組，3h組明顯回落（P＜0.05）。這與前面的凋亡實驗結(jié)果相吻合。提示MKN45細(xì)胞很可能在1h進(jìn)入一個適應(yīng)期，此時細(xì)胞很可能積極調(diào)動自身能力抵抗熱療引起的細(xì)胞損傷。隨著熱療時間的延長，熱療2h細(xì)胞凋亡達(dá)高峰熱療3h，細(xì)胞凋亡減少，而細(xì)胞死亡明顯增多。

圖5 不同熱療時間MKN45細(xì)胞中Puma蛋白的表達(dá)Fig.5Expression of Puma protein of MKN45cells in various time hyperthermia group

討 論

腫瘤熱療主要分為：局部熱療、區(qū)域熱療和整體熱療［4］，是一種利用物理能量使人體全身或局部加熱，使腫瘤組織溫度上升到有效治療溫度，并維持一定時間，利用正常組織和腫瘤組織對溫度耐受力的差異，達(dá)到既能殺滅腫瘤組織，又不損傷正常組織的治療方法［5］。目前，已經(jīng)用于食管癌［6］、胃癌［7］、結(jié)直腸癌［8］等消化系統(tǒng)腫瘤的治療。

文獻(xiàn)還表明［9］，43℃左右的熱療治療胃癌這類空腔臟器腫瘤效果較為確切，但其機(jī)制要比高熱直接殺傷腫瘤細(xì)胞復(fù)雜得多。目前認(rèn)為熱療殺傷腫瘤細(xì)胞主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的［10］。本實驗倒置顯微鏡觀察到熱療后MKN45細(xì)胞體積變小變圓，核膜皺縮，核染色質(zhì)均質(zhì)化，細(xì)胞數(shù)目減少。透射電鏡觀察熱療后MKN45細(xì)胞核仁增多，胞核及胞漿出現(xiàn)大小不等的空泡，并可見凋亡小體。從形態(tài)學(xué)角度證實了熱療可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。接著采用了AO／EB熒光染色法和Annexin－V和PI雙染色流式法檢測熱療誘導(dǎo)胃癌MKN45細(xì)胞凋亡情況。兩種實驗方法結(jié)果均證實熱療可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

研究顯示，細(xì)胞熱療0.5h出現(xiàn)一個凋亡小高峰，而熱療1h細(xì)胞損傷程度略有緩解，提示MKN45細(xì)胞很可能在1h進(jìn)入一個適應(yīng)期，此時細(xì)胞很可能積極調(diào)動自身能力抵抗熱療引起的細(xì)胞損傷。隨著熱療時間的延長，熱療2h細(xì)胞凋亡明顯增加，熱療3h，細(xì)胞凋亡減少，而細(xì)胞死亡明顯增多。本研究AO／EB熒光雙染色實驗結(jié)果各熱療時間組細(xì)胞凋亡率略低于AnnexinⅤ／PI流式細(xì)胞分析法的細(xì)胞凋亡率。這可能是由于部分早期凋亡細(xì)胞雖已出現(xiàn)DNA斷裂，但尚未出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變，因此，AO／EB熒光雙染色未能檢測。MTT結(jié)果表明熱療可明顯抑制胃癌MKN45細(xì)胞增殖，其抑制率隨著熱療時間延長而升高。

胃癌是一種基因相關(guān)性疾?。?1］。P53基因是胃癌重要的抑癌基因［7］，該基因突變而導(dǎo)致其失去正常功能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［12－14］。PUMA是2001年由Nakano K和 Vousden KH等發(fā)現(xiàn)的新基因［15］，其既可介導(dǎo)P53依賴性凋亡，又可介導(dǎo)P53非依賴性凋亡，具有較強(qiáng)的促凋亡活性。研究表明，PUMA在化療藥物、放射線等多種因素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中起著重要作用，且在不同應(yīng)激條件下具有不同的機(jī)制［16－19］。熱療也是一種應(yīng)激。為此，我們推測PUMA參與熱療誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的過程。在本研究中，我們采用免疫印跡檢測MKN45細(xì)胞43℃熱療0.5、1、2和3h后的PUMA蛋白表達(dá)情況。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，MKN45細(xì)胞各熱療時間組PUMA蛋白表達(dá)明顯升高，熱療2h組達(dá)最高峰，1h組略低于0.5h組，3h組明顯回落。這與前面的凋亡實驗及MMT結(jié)果相吻合。提示熱療可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可能是通過上調(diào)PUMA蛋白表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

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