劉 芬，姜清彬，馬英姿，仲崇祿，張 勇，陳 羽，陳 珍

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.中國林科院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520）

7個(gè)短枝木麻黃種源耐寒評(píng)價(jià)及綜合分析

劉 芬1,2，姜清彬2，馬英姿1，仲崇祿2，張 勇2，陳 羽2，陳 珍2

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.中國林科院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520）

對(duì)7個(gè)短枝木麻黃種源的離體小枝在人工氣候箱中進(jìn)行梯度低溫處理, 在25 ℃，5 ℃，0 ℃，-5 ℃ 和-10 ℃溫度下處理24 h，重復(fù)3次，每個(gè)種源的每個(gè)處理采集10株苗的枝條，測定了滲透率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量，可溶性糖含量等9個(gè)耐寒指標(biāo)。通過半致死溫度評(píng)價(jià)了7個(gè)種源的耐寒能力，并通過耐寒指標(biāo)的特征結(jié)合相關(guān)分析對(duì)耐寒指標(biāo)進(jìn)行篩選。運(yùn)用主成分分析、回歸分析和聚類分析對(duì)耐寒指標(biāo)進(jìn)一步綜合分析。結(jié)果表明：利用短枝木麻黃的半致死溫度對(duì)7個(gè)種源進(jìn)行排序，耐寒能力按種源號(hào)依次為18402＞18268＞18119＞18267＞18128＞18015＞18244。用逐步回歸的方式建立短枝木麻黃的耐寒回歸方程為Y=9.462-0.119Chl4-0.026SP1-0.039MDA1+0.051Chla3-0.008Chla2，(R2=1.000)，估計(jì)精度大于98%。

短枝木麻黃；種源耐寒評(píng)價(jià)；低溫脅迫；主成分分析；線性回歸

短枝木麻黃Casuarina equisetifolia耐鹽堿、抗風(fēng)害、沙埋能力強(qiáng)，樹干較通直，主根深長，有根瘤菌固氮，適應(yīng)性強(qiáng)，能在濱海有機(jī)質(zhì)低的沙土上迅速生長[1]，是我國華南沿海防護(hù)林的重要樹種，也是防風(fēng)固沙農(nóng)田防護(hù)林的先鋒樹種之一[2]。但是由于短枝木麻黃不耐寒，嚴(yán)重限制了其栽種范圍，且近年來的極端氣溫頻繁出現(xiàn)，對(duì)耐寒的短枝木麻黃的選育得尤為重要。木麻黃的耐寒研究，主要集中在耐寒性比較及對(duì)耐寒獨(dú)立指標(biāo)的分析[3-5]，未對(duì)耐寒指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。本文通過結(jié)合主成分分析、線性回歸分析、及聚類分析，旨在建立短枝木麻黃在寒冷脅迫下的耐寒評(píng)價(jià)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的7個(gè)種源的短枝木麻黃種子由澳大利亞林木種子中心（CSIRO）提供，種源信息見表1。2012年4月播種，6月移栽于試驗(yàn)地苗圃。試驗(yàn)地設(shè)在廣州市中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所苗圃，位于東經(jīng)113°15′，北緯23°6′，海拔43 m。屬于南亞熱帶季風(fēng)氣候，熱量充足，年平均氣溫22℃，極端最高溫39.3℃，極端最低溫0℃。雨量充沛，年均降雨量1 800 mm，主要集中在4～9月，年平均相對(duì)濕度74%。

表1 7個(gè)參試種源的種源信息Table 1 Information of 7 experimental provenances

1.2 方法

1.2.1 低溫處理

人工氣候箱中，采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，參試種源7個(gè)，苗齡為2a，以每種源隨機(jī)選取10株苗的30個(gè)離體小枝條作為生理指標(biāo)測試材料，采用25 ℃，5 ℃，0 ℃，-5 ℃，-10 ℃五個(gè)溫度梯度處理24 h，其中25℃為對(duì)照溫度組，每個(gè)溫度處理重復(fù)3次，合計(jì)處理苗木數(shù)為1 050株，即7種源×5溫度處理×10株×3重復(fù)。

1.2.2 生理指標(biāo)測定

小枝的電解質(zhì)滲透率（REC）采用電導(dǎo)率法[6:203-204]；丙二醛含量（MDA）用硫代巴比妥酸法[7]；蒽酮比色法[8:144-148]測定可溶性糖含量（SS）；磺基水楊酸法[8:228-231]測定脯氨酸含量(Pro)；考馬斯亮藍(lán)G-250法[8:142-143]測定可溶性蛋白(SP)；超氧化物歧化酶活性（SOD）采用NBT光化還原法[6:191-193]，葉綠素a含量（Chla）、葉綠素b含量(Chlb)、總?cè)~綠素含量(Chl)采用丙酮-乙醇混合液浸提比色法[8:74-77]。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)整理與分析采用Microsoft Excel 2010，用皮爾遜積差進(jìn)行相關(guān)分析，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析、回歸分析和聚類分析。以處理溫度和電解質(zhì)滲透率擬合Logistic曲線計(jì)算半致死溫度LT50，具體計(jì)算方法參考時(shí)朝等[9]的方法。

除電解質(zhì)滲透率外的8個(gè)耐寒指標(biāo)，為消除不同量綱數(shù)據(jù)處理帶來的影響，通過公式計(jì)算成耐寒系數(shù)[10]：各指標(biāo)耐寒系數(shù)（α）=處理測定值/對(duì)照測定值

2 結(jié)果與分析

2.1 寒冷脅迫對(duì)抗寒生理指標(biāo)的影響及耐寒指標(biāo)篩選

2.1.1 寒冷脅迫對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)指標(biāo)的影響

由表2可知，小枝的電解質(zhì)相對(duì)滲透率均隨著溫度的降低逐漸上升，在5 ℃，0 ℃滲透率變化幅度小，說明該溫度對(duì)細(xì)胞膜的破壞性不大，繼續(xù)降溫到在-5 ℃，-10 ℃處相對(duì)電導(dǎo)率大幅度，膜透性增加，細(xì)胞膜遭到破壞。

植物在遭受傷害時(shí)與膜脂的過氧化作用密切相關(guān)，MDA反映植物在遭受傷害的過程中膜過脂氧化物的程度?？傮w的MDA含量均是處理組大于對(duì)照組，但在5 ℃～0 ℃過程中有兩個(gè)種源的MDA 含量低于對(duì)照組，該溫度處的MDA含量可能與耐寒性相關(guān)，記為MDA1。在5個(gè)處理溫度處理下，MDA 的含量總體的趨勢呈M型或N型（表2），說明在5 ℃附近植物有一個(gè)明顯的自我修復(fù)的過程，但在-5 ℃～10 ℃處，MDA的變化趨勢不一，記為MDA2。

2.1.2 寒冷脅迫對(duì)滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖，是植物細(xì)胞中重要的滲透物質(zhì)。在低溫鍛煉過程中，可溶性蛋白含量、可溶性糖和游離脯氨酸都呈現(xiàn)出兩種變化，一種為逐漸上升，可能是在溫度降低以后，可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量的增加，可以有效提高細(xì)胞內(nèi)的束縛水的能力，降低細(xì)胞的冰點(diǎn)，說明這些種源的抗性仍有繼續(xù)擴(kuò)大的可能性[11]。另一種為先升后降，可能是過低的溫度使得植物細(xì)胞的機(jī)體運(yùn)行能力下降，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)開始降解[12:16-19]。不同種源的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力體現(xiàn)植物的耐寒能力。對(duì)照～5 ℃和0 ℃～-5 ℃的可溶性蛋白呈顯著正相關(guān)（表3），分別記為SP1和SP2。-5 ℃～-10 ℃的可溶性糖變化趨勢不一，記為SS1。

表2 不同溫度處理對(duì)參試種源生理指標(biāo)的影響?Table 2 Effects of different concentrations frost stress on physiological indicators of tested provenances

表3 LT50與不同溫度下耐寒指標(biāo)的相關(guān)分析?Table 3 Correlation analyze between LT50 and cold tolerance index at different temperature

2.1.3 寒冷脅迫對(duì)保護(hù)性酶和光合物質(zhì)的影響

在植物體遭受寒冷脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的自由基增加，SOD是植物體內(nèi)清除自由基的重要酶之一，在本實(shí)驗(yàn)中，SOD出現(xiàn)反復(fù)的波動(dòng)，體現(xiàn)了SOD在植物體內(nèi)保持修復(fù)平衡。在對(duì)照～5 ℃和-5 ℃到-10 ℃處的變化趨勢出現(xiàn)分歧，分別記為SOD1，SOD2。

類囊體膜的組分、透性和流動(dòng)性、及其葉綠素會(huì)響應(yīng)植物體的低溫脅迫[13]。隨著溫度的降低，7個(gè)種源的短枝木麻黃的總?cè)~綠素含量，葉綠素a/b含量都呈現(xiàn)先增加后減少或是平穩(wěn)的趨勢，這與柏科的結(jié)果一致[12:19-20]，隨著溫度的降低，細(xì)胞開始脫水，而葉綠體還保持其光合的能力，因此葉綠素的相對(duì)含量升高。溫度繼續(xù)降低，葉綠體的結(jié)構(gòu)遭到破壞，葉綠素的活性受到抑制甚至葉綠素本身開始降解，使得葉綠素含量降低，這與木麻黃在低溫下的枝條變紅褐色的形態(tài)結(jié)果一致。葉綠素a的變化趨勢呈現(xiàn)出兩個(gè)大的方向，可能與耐寒性相關(guān)，4個(gè)溫度區(qū)間的葉綠素含量分別記為 Chl1，Chl2，Chl3和Chl4；葉綠素 b的含量在5 ℃～-0 ℃和0 ℃～-5 ℃出現(xiàn)三個(gè)明顯不同的變化趨勢，分別記為Chlb1和Chlb2。在0～-5℃區(qū)間的總?cè)~綠素記為Chl1。

2.1.4 半致死溫度LT50的確定

LT50能有效的反映植物的耐寒性能，通過相對(duì)滲透率擬合Logistic曲線[14]求出各種源半致死溫度LT50。半致死溫度均在-5℃附近，依據(jù)半致死溫度對(duì)短枝木麻黃耐寒性進(jìn)行排序依次為18402（-5.956 ℃）＞ 18268（-5.930 ℃）＞ 18119（-5.494℃）＞ 18267（-5.220℃） ＞ 18128（-4.940℃） ＞18015（-3.669℃）＞18244（-3.475℃）。

2.2 短枝木麻黃抗寒性綜合評(píng)價(jià)體系的建立

根據(jù)上述上生理指標(biāo)的分析，篩選出的15個(gè)與短枝木麻黃抗寒性密切相關(guān)的單項(xiàng)生理指標(biāo)。即 LT50，MDA1，MDA2，SP1，SP2，SS1，SOD1，SOD2，Chla1，Chla2，Chla3，Chla4，Chlb1，Chlb2，Chl1。

2.2.1 主成分分析

以15個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)為變量進(jìn)行主成分分析，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到96.314%，說明該15個(gè)指標(biāo)已經(jīng)包含了短枝木麻黃耐寒的大部分信息。主成分1包含的信息主要為葉綠素a，保護(hù)酶和可溶性蛋白。主成分2主要攜帶膜系統(tǒng)和SS1的信息。主成分3攜帶葉綠素b和SP的信息，主成分4攜帶的信息為總?cè)~綠素，最后一個(gè)主成分?jǐn)y帶SOD的信息。從各種源在各主成分的得分情況看，在各種源的得分最高的主成分不盡相同，在4個(gè)主成分中都有分布。因此難以通過種源在主成分的得分情況揭示短枝木麻黃耐寒的特性。還需借助回歸進(jìn)一步分析。

表4 短枝木麻黃耐寒綜合評(píng)價(jià)主成分分析Table 4 Principal component evaluation based on cold tolerance of C. equisetifolia

表5 參試種源主成分得分Table 5 Principal component factor scores of tested provenances

2.2.2 回歸分析

以LT50為因變量，剩下的14個(gè)指標(biāo)作為自變量，以回歸方程中F檢驗(yàn)的相伴概率值小于0.05的選入方程，大于0.1的移出方程進(jìn)行逐步回歸分 析。14個(gè) 指 標(biāo) 中 Chla2，Chla3，Chla4，SP1，MDA1被引入方程，回歸方程為：

從回歸方程可以看出短枝木麻黃的耐寒性主要與葉綠素a在-5 ℃～-10 ℃的變化呈負(fù)相關(guān)，也與葉綠素a在0 ℃～5 ℃呈一定的正相關(guān)。將數(shù)據(jù)代入方程對(duì)方程精度進(jìn)行評(píng)價(jià)，由表6 可知方程的估計(jì)精度均在98%以上，說明該方程符合對(duì)短枝木麻黃耐寒性評(píng)價(jià)的要求。

表6 回歸方程的估計(jì)精度分析Table 6 Estimated accuracy analysis of regression equation

2.2.3 聚類分析

通過回歸得出影響短枝木麻黃耐寒性的5個(gè)指標(biāo)，以LT50和5個(gè)指標(biāo)的耐寒系數(shù)進(jìn)行聚類分析（表7），第一類中，半致死溫度低，光合物質(zhì)的平均值在4個(gè)類別中都是最大值。第二類中，半致死溫度較低，光合物質(zhì)的平均值都處于中等水平，但可溶性蛋白在對(duì)照～5 ℃處處于4類中的最高水平。第三類的半致死溫度明顯低于第二類，Chla4在4類中最低，且MDA的含量在5 ℃～0 ℃溫度變化過程中偏高SP1也比第二類低很多。第四類半致死溫度最高，最不耐寒，光合物質(zhì)相比前三大類別都偏低。

表7 聚類分析結(jié)果Table 7 Results of cluster analysis

3 結(jié)論與討論

寒冷脅迫是植物重要的環(huán)境脅迫之一，植物的抗寒性與自然對(duì)植物的選擇和植物對(duì)自然的適應(yīng)過程中，微效并特異的抗寒基因進(jìn)調(diào)控有關(guān)。低溫半致死溫度是植物在遭受寒冷脅迫后能否恢復(fù)生長的一個(gè)臨界值，能較準(zhǔn)確反映植物的抗寒能力[15-17]。本試驗(yàn)通過短枝木麻黃小枝在低溫脅迫下的滲透率擬合Logistic曲線得出半致死溫度，根據(jù)半致死溫度對(duì)7個(gè)種源的耐寒順序排序，各種源號(hào)的耐寒力從大到小依次為18402＞18268＞18119＞18267＞18128＞18015＞18244。

主成分分析可以簡化數(shù)據(jù)集，保持對(duì)方差貢獻(xiàn)大的數(shù)據(jù)。本文通過單項(xiàng)指標(biāo)分析結(jié)合相關(guān)分析對(duì)耐寒指標(biāo)進(jìn)行簡化選出與耐寒性密切相關(guān)的15個(gè)指標(biāo)。通過主成分分析，15個(gè)指標(biāo)的貢獻(xiàn)率達(dá)到96.341%，說明該15個(gè)指標(biāo)包含短枝木麻黃耐寒的大部分信息。通過線性回歸對(duì)指標(biāo)進(jìn)一步篩選，并得出回歸方程LT50=9.462-0.119Chl4-0.026SP1-0.039MDA1+0.051Chla3-0.008Chla2，通過半致死溫度的精度分析和聚類分析進(jìn)行驗(yàn)證。

在植物中，耐寒能力強(qiáng)的植物保持光合作用的能力要比耐寒性差的強(qiáng)[18-19]。植物在低溫逆境下葉綠素降低，光和機(jī)能的破壞導(dǎo)致植物死亡[20-21]。在本文中葉綠素a的含量在回歸方程中占三個(gè)指標(biāo)，體現(xiàn)了其對(duì)短枝木麻黃耐寒性的影響的重要性。經(jīng)過聚類分析也表明，葉綠素a的含量是影響聚類結(jié)果的重要的指標(biāo)。

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Evaluation and Comprehensive Analysis of Cold Tolerance on SevenCasuarina equisetifoliaProvenances

LIU Fen1,2, JIANG Qin-bin2, MA Ying-zi1, ZHONG Chong-lu2, ZHANG Yong2, CHEN Yu2, CHEN Zhen2
(1.Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Research Institute of Tropical Forestry,CAF, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

The 9 physiological traits were measured with seedlings of sevenCasuarina equisetifoliaprovenances, which treated under fi ve low temperature gradients (25℃ , 5℃ , 0℃ , -5℃ and -10℃ ) for 24 hours, the test was repeated 3 times. Ten seedlings’ branches on per treatment per provenance were collected, and theirs nine cold resistance indexes such as permeability, MDA, proline content,soluble protein content, soluble sugar content, etc. were determined in artif i cial climate chamber. The cold resistance capability were evaluated by semilethal temperature(LT50). Combined correlation analysis and characteristics analysis, the cold-resistant indexes were screened. Principal component, regression and cluster analysis were used for further comprehensive analysis on the selected coldresistant indexes. The results show that sevenC. equisetifoliaprovenances were sequenced in freeze resistance capability according to their semi-lethal temperature from big to small as follows: 18402＞ 18268＞ 18119＞ 18267＞ 18128 ＞ 18015 ＞ 18244; The regression equation was built by stepwise regression method: LT50=9.462-0.119Chl4-0.026SP1-0.039MDA1+0.051Chla3-0.008Chla2,(R2=1.000), the estimation accuracy of the model was higher than 98%.

Casuarina equisetifolia; provenance cold tolerance evaluation; low temperature stress; principal component analysis; linear regression

S718.43；S792.93

A

1673-923X(2015)06-0040-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.06.008

2014-11-05

十二五科技支撐計(jì)劃任務(wù)（2012BAD01B0603）；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新招標(biāo)項(xiàng)目（201401）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金（RITFYWZX201203）

劉 芬，碩士研究生 通訊作者：馬英姿，博士，教授

劉 芬，姜清彬，馬英姿，等. 7個(gè)短枝木麻黃種源耐寒評(píng)價(jià)及綜合分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(6):40-44,62.

[本文編校：吳 彬]