賀俊斌，龍 寒，林日輝，梁宇薇，陳陽(yáng)陽(yáng)，高 華，黃奇良

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

草酸脫羧酶促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶溶解的體外研究

賀俊斌1，龍 寒1，林日輝2,*，梁宇薇1，陳陽(yáng)陽(yáng)1，高 華1，黃奇良2

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

在體外實(shí)驗(yàn)條件下，考察了加酶量、反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度及其產(chǎn)物甲酸根等因素對(duì)草酸脫羧酶催化草酸降解從而促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶重新溶解過(guò)程的影響。結(jié)果表明，在10 mL反應(yīng)體系中，添加4 U草酸脫羧酶，反應(yīng)pH 3.0，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)進(jìn)行1 周（168 h），可使近5%的草酸鈣結(jié)晶重新溶解；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，草酸降解產(chǎn)物甲酸根對(duì)草酸脫羧酶促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶溶解產(chǎn)生抑制作用。

草酸脫羧酶；草酸鈣；溶解

泌尿系結(jié)石是泌尿外 科的常見病和多發(fā)病，該病的主要特點(diǎn)是臨床治愈后具有明顯的復(fù)發(fā)傾向，大約25%～75%的患者在初次發(fā)病后的10～20 a內(nèi)會(huì)再次發(fā)生結(jié)石，給患者帶來(lái)了極大的痛苦。研究表明，泌尿系結(jié)石中大約有70%～80%為草酸鈣結(jié)石[1-2]。目前，雖然這類疾病可通過(guò)物理、化學(xué)方法，如化學(xué)藥物治療、體外沖擊波碎石術(shù)、輸尿管鏡碎石術(shù)、經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)等[3]方法治療，并取得一定療效，但物理化學(xué)方法對(duì)人體副作用較大、治療費(fèi)用昂貴，且結(jié)石復(fù)發(fā)率高。因此，尋求較溫和的治療方法，減輕結(jié)石病患者的痛苦顯得尤為重要。生物酶具有高效性、專一性和溫和性等作用特點(diǎn)，且已經(jīng)有服用某種酶制劑進(jìn)行降解人體內(nèi)的草酸鹽以預(yù)防治療草酸鹽結(jié)石癥的報(bào)道[4-5]。因此，利用可分解草酸的酶制成酶制劑，以預(yù)防治療草酸鈣結(jié)石癥已成為重要的研究方向。

草酸脫羧酶（oxalate decarboxylase，Oxdc，EC 4.1.1.2）是一種包含Mn2+的均一聚合酶，催化草酸轉(zhuǎn)化為甲酸和CO2（圖1），屬cupin蛋白超家族，是植物、微生物中草酸代謝降解的主要催化酶之一[6]。該酶最早由Shimazono[7]發(fā)現(xiàn)于白腐菌中，它主要來(lái)源于黑曲霉、核盤菌、金針菇和褐腐菌等真菌[8]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在低pH值條件下也能誘導(dǎo)合成Oxdc[9]，動(dòng)物中只在豚鼠（天竺鼠）的肝臟中發(fā)現(xiàn)該酶[10]?；贠xdc廣泛的微生物來(lái)源、對(duì)底物的高度特異性以及酶促反應(yīng)的高效性等特點(diǎn)，將該酶應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療等領(lǐng)域中的草酸鹽降解獲得了廣泛的關(guān)注[11-12]。

圖1 Oxdc催化草酸的脫羧反應(yīng)Fig.1 Decarboxylation of oxalic acid catalyzed by oxalate decarboxylase

溶解與結(jié)晶是一個(gè)反應(yīng)平衡，只要不斷移除或破壞溶質(zhì)分子，就可以使平衡向溶解方向移動(dòng)。為了探討Oxdc催化草酸降解對(duì)草酸鈣結(jié)晶重新溶解的促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)在體外模擬尿液環(huán)境，采用來(lái)源于Bacillus subtilis 的Oxdc處理草酸鈣結(jié)晶物，通過(guò)電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[13-14]（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）測(cè)定反應(yīng)體系中Ca2+濃度的變化，評(píng)價(jià)Oxdc在體外促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶溶解的能力及影響因素，以期為Oxdc酶制劑應(yīng)用于防治草酸鈣結(jié)石癥提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

基因工程菌E. coli BL21（DE3）/pET32a/YvrK廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；LB培養(yǎng)基組成：1 L培養(yǎng)基含蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g；LB固體培養(yǎng)基添加18 g瓊脂粉。

草酸鉀、甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH） 美國(guó)Sigma公司；氨芐青霉素 美國(guó)Amresco公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 德國(guó)Merck公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD） 瑞士Roche公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。模擬尿液：配制pH 4.0的醋酸鹽緩沖液，添加尿液中的主要成分[15]：NaCl、枸櫞酸三鈉、Na2SO4、NaH2PO4、MgSO4、KCl、NH4Cl。

HisTrap HP親和柱和凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；快速蛋白液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)通用公司；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司；CR-22G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；Sigma 1-13高速臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；超低溫冰箱 美國(guó)Beckman公司；4 ℃冰箱 中國(guó)海爾集團(tuán)；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；iCAP 6300型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 Oxdc的制備與酶活力檢測(cè)

Oxdc的制備參考文獻(xiàn)[16-17]方法，培養(yǎng)發(fā)酵基因工程菌E. coli BL21（DE3）/pET32a/YvrK，添加IPTG至終濃度0.4 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，離心收集菌體，以pH 8.0磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎，收集上清即為粗酶液，用快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)AKTA-FPLC對(duì)粗酶液進(jìn)行純化。使用AKTA-FPLC系統(tǒng)對(duì)Oxdc粗酶液進(jìn)行純化前，預(yù)先用 0.45 μm孔徑水性濾膜對(duì)Oxdc粗酶液進(jìn)行抽濾，去除部分顆粒雜質(zhì)。方法：1）平衡，在親和柱上樣前先用緩沖液A過(guò)柱，平衡至基準(zhǔn)線基本形成一條直線；2）上樣，將預(yù)處理的粗酶液在冰浴條件下以1 mL/min流速過(guò)柱，蛋白質(zhì)即吸附在親和柱上；3）洗脫，親和柱先用A液洗脫80 mL，含A液90%、B液10%的混合緩沖液洗脫40 mL，再將B液體積分?jǐn)?shù)從10%升至100%進(jìn)行線性洗脫。具體溶液配制：A液，配制50 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液，加入咪唑至終濃度20 mmol/L，NaCl至終濃度0.5 mol/L，調(diào)節(jié)pH值至8.0；B液，配制50 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液，加入咪唑至終濃度500 mmol/L，NaCl至終濃度0.5 mol/L，調(diào)節(jié)pH值至8.0。收集出峰的對(duì)應(yīng)管即為Oxdc純化酶。

Oxdc的酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]方法。酶活力單位（ U）定義為：每分鐘催化轉(zhuǎn)化草酸產(chǎn)生1 μmol甲酸的酶量為一個(gè)酶活力單位。

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)測(cè)得Oxdc純化酶活力為14.33 U/mL，蛋白質(zhì)含量為2.26 mg/mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

Ca標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取甲酸鈣結(jié)晶0.130 1 g（精確至0.000 1 g），放入100 mL容量瓶中，用上述模擬尿液定容。標(biāo)準(zhǔn)工作液：配制不同濃度的Ca標(biāo)準(zhǔn)溶液，供電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定。

以模擬尿液作為零點(diǎn)，測(cè)定系列濃度的Ca2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，以Ca2+濃度為橫坐標(biāo)，信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在譜線373.69 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，Ca靈敏度高，無(wú)其他光譜干擾；Ca2+的濃度在0.005～2.56 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，線性關(guān)系良好，其回歸方程為：y=288 301x+6 882.5，相關(guān)系數(shù)為0.999 0。

1.2.3 Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 加酶量對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響

準(zhǔn)確稱取25 mg（精確至0.000 1 g）草酸鈣結(jié)晶置于錐形瓶中，加入10 mL模擬尿液，再分別加入1、2、4 U Oxdc，混勻后，37 ℃恒溫振蕩進(jìn)行溶解反應(yīng)，設(shè)計(jì)3 組平行實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣檢測(cè)體系中Ca2+濃度的變化，取平均值。

1.2.3.2 反應(yīng)pH值對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響

準(zhǔn)確稱取25 mg（精確至0.000 1 g）草酸鈣結(jié)晶置于錐形瓶中，加入10 mL模擬尿液，調(diào)節(jié)pH值分別至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.5、6.5，分別加入4 U Oxdc，混勻后，37 ℃恒溫振蕩進(jìn)行溶解反應(yīng)1 周，并做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)（不加Oxdc）；設(shè)計(jì)3 組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定體系中Ca2+的濃度，取平均值。

1.2.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響

準(zhǔn)確稱取25 mg（精確至0.000 1 g）草酸鈣結(jié)晶置于錐形瓶中，加入10 mL模擬尿液，加入4 U Oxdc，混勻后，分別在30、33、35、37、40 ℃條件下恒溫振蕩進(jìn)行溶解反應(yīng)1 周，并做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)（不加Oxdc），設(shè)計(jì)3 組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定體系中Ca2+的濃度，取平均值。

1.2.3.4 反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響

準(zhǔn)確稱取25 mg（精確至0.000 1 g）草酸鈣結(jié)晶置于錐形瓶中，加入10 mL模擬尿液，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的甲酸鈉，再分別加入4 U Oxdc，混勻后，37 ℃恒溫振蕩進(jìn)行溶解反應(yīng)1 周；并做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)（不加Oxdc），設(shè)計(jì)3 組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定體系中Ca2+的濃度，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加酶量對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響

圖2 加酶量對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響Fig.2 Effect of Oxdc dosage on the dissolution of calcium oxalate crystals

如圖2所示，添加不同酶量的Oxdc對(duì)催化草酸鈣結(jié)晶溶解的速率有很大的影響。隨Oxdc用量的增加及反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，催化草酸鈣結(jié)晶溶解產(chǎn)生的Ca2+增多；添加1 U Oxdc的催化反應(yīng)在96 h前Ca2+濃度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，隨后基本保持平衡。添加2 U Oxdc的催化反應(yīng)中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中Ca2+的濃度逐漸上升，并在168 h后Ca2+濃度達(dá)到最大值0.89 mmol/L，相當(dāng)于溶解了1.30 mg的草酸鈣結(jié)晶。添加4 U Oxdc的催化反應(yīng)中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，草酸鈣結(jié)晶溶解的速率明顯加快，并在120 h時(shí)趨于平緩，反應(yīng)進(jìn)行168 h后，體系中Ca2+濃度達(dá)到最大值1.14 mmol/L，相當(dāng)于溶解了1.67 mg的草酸鈣結(jié)晶。而不加Oxdc的空白對(duì)照組中Ca2+濃度基本保持不變，說(shuō)明Oxdc可催化草酸鈣結(jié)晶進(jìn)行進(jìn)一步的溶解。

2.2 不同反應(yīng)pH值對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響

圖3 反應(yīng)pH值對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響Fig.3 Effect of pH on the dissolution of calcium oxalate crystals

如圖3所示，在不同反應(yīng)pH值的模擬尿液中進(jìn)行Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的反應(yīng)，未加Oxdc的空白對(duì)照組在pH 2.5～4.5之間Ca2+濃度基本保持不變，之后隨著pH值的增加，草酸鈣結(jié)晶的溶解速率迅速減小，這可能是因?yàn)槟M尿液中的枸櫞酸鹽等相關(guān)成分影響了草酸鈣結(jié)晶的溶解，從而降低了體系中Ca2+的含量。而添加4 U Oxdc的反應(yīng)體系中Ca2+濃度在pH 3.0時(shí)達(dá)到最大值（約1.08 mmol/L），隨后逐漸下降，并在pH 5.5時(shí)體系中Ca2+的濃度與未加Oxd c的空白對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，這與Oxdc的酶活力相關(guān)，因?yàn)镺xdc進(jìn)行催化反應(yīng)的pH值偏酸性（最適pH 3.5），當(dāng)pH＞4.5時(shí)酶促反應(yīng)速率隨pH值升高而下降，pH 6.5時(shí)酶活力基本喪失。

2.3 不同反應(yīng)溫度對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響Fig.4 Effect of temperature on the dissolution of calcium oxalate crystals

如圖4所示，隨著反應(yīng)溫度的升高，添加4 U Oxdc的反應(yīng)體系中Ca2+濃度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，并在37 ℃時(shí)其溶解速率趨于平緩，而未加Oxdc的反應(yīng)體系中Ca2+濃度基本保持不變。說(shuō)明Oxdc在37～40 ℃條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，可達(dá)到相對(duì)較高的酶活力，這與Oxdc在35～40 ℃條件下，既可達(dá)到相對(duì)較高的酶活力，又可避免高溫對(duì)酶結(jié)構(gòu)破壞的結(jié)果一致[16]。

2.4 反應(yīng)產(chǎn)物濃度對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響

Ox dc催化草酸鈣結(jié)晶轉(zhuǎn)化為甲酸鈣和CO2，其催化反應(yīng)速率在某種程度上受產(chǎn)物的抑制作用[19]。研究表明，產(chǎn)物甲酸根可能與Oxdc結(jié)構(gòu)中的錳離子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制Oxdc的酶活性[20]。產(chǎn)物影響Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶 反應(yīng)的結(jié)果如圖5所示，隨著體系中甲酸根的增多，未加Oxdc的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)中Ca2+濃度逐漸下降，這是由于甲酸根對(duì)草酸鈣結(jié)晶具有較強(qiáng)的聚集作用，從而減小草酸鈣結(jié)晶的溶解性；而添加4 U Oxdc的反應(yīng)體系中Ca2+濃度也隨著產(chǎn)物甲酸根的增多而減小，并在甲酸根達(dá)到0.8 mmol/L時(shí)Ca2+濃 度達(dá)到最小值，隨后趨于平衡，說(shuō)明催化反應(yīng)體系中添加的甲酸根與產(chǎn)物甲酸根達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)對(duì)Oxdc的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生 影響，當(dāng)添加的甲酸根達(dá)到0.8 mmol/L時(shí)，Oxdc的酶活力可能基本喪失，草酸鈣結(jié)晶溶解的速率降低，這與添加200 μg Oxdc于10 mL pH 4.2的醋酸鹽緩沖液中進(jìn)行草酸鈣結(jié)晶溶解反應(yīng)5 d后，體系中再添加10 U FDH和1 U NAD+進(jìn)行將甲酸鹽轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽，從而減小產(chǎn)物抑制作用，增加草酸鈣結(jié)晶溶解速率的結(jié)果一致[21]。

圖5 反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)Oxdc溶解草酸鈣結(jié)晶的影響Fig.5 Effect of reaction product on the dissolution of calcium oxalate crystals

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在體外模擬尿液體系中采用來(lái)源于Bacillus subtilis的Oxdc進(jìn)行了草酸鈣結(jié)晶重溶解的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定催化反應(yīng)體系中Ca2+的濃度變化，評(píng)價(jià)了Oxdc在體外溶解草酸鈣結(jié)晶的能力及影響因素。結(jié)果表明，隨著加酶量的增加，Oxdc催化草酸鈣結(jié)晶溶解的速率加快，添加4 U Oxdc進(jìn)行催化草酸鈣結(jié)晶溶解168 h后，可溶解約6.68%的草酸鈣結(jié)晶，而未加Oxdc的空白對(duì)照組中溶解了約1.8%的草酸鈣結(jié)晶?？疾煊绊懸蛩匮芯堪l(fā)現(xiàn)，當(dāng)模擬尿液pH值為3.0，反應(yīng)溫度在37～40 ℃條件下，Oxdc催化草酸鈣結(jié)晶溶解的速率最快；而產(chǎn)物甲酸根是影響Oxdc催化草酸鈣結(jié)晶溶解速率的重要因素，當(dāng)反應(yīng)體系中產(chǎn)生的甲酸根達(dá)到一定濃度時(shí)，Oxdc的結(jié)構(gòu)可能受到影響，因而影響了Oxdc的酶活性，減小了草酸鈣結(jié)晶溶解的速率。因此，Oxdc催化草酸鈣結(jié)晶溶解的過(guò)程中，應(yīng)通過(guò)添加其他分解甲酸根的酶或替代品，減少產(chǎn)物抑制酶活性的作用，以提高草酸鈣結(jié)晶溶解的速率。此外，來(lái)源于Bacillus subtilis的Oxdc催化草酸分解的Km為15 mmol/L[20]，在上述實(shí)驗(yàn)中獲得的最大反應(yīng)速率未達(dá)到該酶真正的最大反應(yīng)速率。因此，對(duì)來(lái)源于Bacillus subtilis的Oxdc進(jìn)行突變改造或化學(xué)修飾，降低反應(yīng)Km，改善其催化性能是后續(xù)研究的重要工作之一。本實(shí)驗(yàn)為Oxdc應(yīng)用于防治草酸鈣結(jié)石癥提供了理論基礎(chǔ)。

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Oxalate Decarboxylase Promotes the in vitro Dissolution of Calcium Oxalate Crystals

HE Junbin1, LONG Han1, LIN Rihui2,*, LIANG Yuwei1, CHEN Yangyang1, GAO Hua1, HUANG Qiliang2
(1. Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources, School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China; 2. Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China)

Crystallization of calcium oxalate in the urinary system is one of the important causes of urinary stones, and enzymatic degradation of oxalic acid for preventing calcium oxalate stones has become a research hotspot. Under in vitro experimental conditions, the factors that affect the re-dissolution of calcium oxalate crystals catalyzed by oxalate decarboxylase were studied. The results indicated that when 4 U of oxalate decarboxylase was added to the 10-mL reaction system which was subsequently allowed to react at pH 3.0 and 37 ℃ for a week, the re-dissolution rate of calcium oxalate crystals was approximately 5%. The experimental results showed that the degradation product formate produced an inhibitory effect on the re-dissolution of calcium oxalate crystals catalyzed by oxalate decarboxylase. This experiment provides a theoretical reference for the study of enzyme preparation to control calcium oxalate stones.

oxalate decarboxylase; calcium oxalate; dissolution

Q814

A

1002-6630（2015）19-0159-04

10.7506/spkx1002-6630-201519028

2014-10-22

教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（教外司留[2012]1707號(hào)）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014jjAA20030）

賀俊斌（1992-），男，碩士研究生，主要從事生物化工研究。E-mail：hejunbin556298@163.com

*通信作者：林日輝（1972-），男，研究員，博士，主要從事化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化研究。E-mail：rihuilin@aliyun.com