液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米中多菌靈殘留量的不確定度分析

李菊穎，何 健，孔德洋，單正軍*

（環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米中多菌靈殘留量的不確定度分析

李菊穎，何 健，孔德洋，單正軍*

（環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042）

建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定糧谷中的多菌靈的不確定度分析方法。根據(jù)JJF 1059—1999《測量不確定度評定與表示》中有關(guān)規(guī)定，建立不確定度評定的數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的來源，并對不確定度分量進(jìn)行量化和合成。評定結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和體積量取所產(chǎn)生的不確定度分量較大；大米中多菌靈含量為0.033 5 mg/kg 時，其擴(kuò)展不確定度為0.002 2 mg/kg（k=2）。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；多菌靈；不確定度；大米

多菌靈是一種廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，是我國最常用的殺菌劑之一，在食品中使用廣泛，范圍包括谷物、油料油脂、蔬菜、水果、堅(jiān)果、糖料、飲料和調(diào)味品等[1]。近年來，多菌靈的內(nèi)分泌干擾性[2-3]、生殖毒性[4-6]和致畸性[7-8]已引起國外廣泛關(guān)注，但國內(nèi)不斷的有多菌靈在各類食品殘留檢出的報道[9-12]。糧谷是我國主食，成分復(fù)雜，較蔬菜、水果中的農(nóng)藥殘留分析難度大。筆者在長期檢測各類糧谷中農(nóng)藥殘留時發(fā)現(xiàn)，多菌靈的陽性率很高。為了確保檢測結(jié)果的可信度，必須進(jìn)行測量不確定度的評定。測量不確定度分析評定是日常檢測工作中的重要技術(shù)組成部分，對于質(zhì)量控制也具有重要意義。目前有關(guān)氣相色譜法[13-15]、液相色譜法[16]和氣相色譜-質(zhì)譜法[17-20]的不確定度評價方法較多，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）法的相關(guān)研究基本空缺。本研究參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[21-23]，通過GB/T 20770—2008《糧谷中486種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[24]評定大米中多菌靈殘留量的不確定度，為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)，同時為測量其他農(nóng)藥殘留量的不確定評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度（98.6±0.4）%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；甲苯、乙腈（均為色譜純）德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB SCIEX Triple Quad 4500超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國AB公司；CPA224S電子天平（0.1 mg） 美國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理

按照GB/T 20770—2008的要求，稱取10 g大米試樣（精確至0.01 g），放入盛有15 g無水硫酸鎂的具塞離心管中，加入35 mL乙腈，3 800 r/min離心5 min，取上清液通過裝有無水硫酸鈉的筒形漏斗，收集于梨形瓶中，殘?jiān)儆?0 mL乙腈提取一次，合并提取液，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL，加入5 mL乙酸乙酯-正己烷（1∶1，V/V）溶液進(jìn)行溶劑交換，重復(fù)2 次，最后使樣品體積為5 mL，待凈化。

1.3.2 凝膠滲透色譜凈化

凈化柱：400 mm×25 mm（內(nèi)徑）；填料：BIOBeads S-X3；檢測波長254 nm；流動相：乙酸乙酯-正己烷（1∶1，V/V）溶液；流速5 mL/min；進(jìn)樣體積5 mL；開始收集時間22 min；結(jié)束收集時間40 min。

凈化：將上述提取液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用5 mL乙酸乙酯-正己烷溶液分2 次洗滌梨形瓶，并轉(zhuǎn)移至上述10 mL容量瓶中，定容搖勻，0.45 μm濾膜過濾，收集溜分于梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5 mL，乙腈-水（3∶2，V/V）溶液定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待LCMS-MS測定。

1.3.3 LC條件

Agilent C18色譜柱（2.7 mm×75 mm，2.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相：A：乙腈，B：0.01%甲酸溶液，流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序?yàn)?.00 min，1% A；3.0 min，30% A；4 min，50% A；4.3 min，90% A，4.6 min，1% A；5 min，1% A；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4 MS條件

正離子掃描方式，多反應(yīng)檢測；離子源噴霧器電壓4 800 V；離子源溫度540 ℃；窗簾氣壓力30.00 psi；霧化氣壓力50 psi；輔助加熱氣壓力55 psi；碰撞氣壓力5.00 psi；定性離子對為192.1/160.1和192.1/132.1；定量離子對192.1/132.1；去簇電壓80 V；碰撞能量為15 V和20 V。

1.4 數(shù)學(xué)模型的建立

被測物殘留量X按公式（1）計算：

式中：X為試樣中被測物殘留量/（mg/kg）；C0為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中被測組分的質(zhì)量濃度/（mg/L）；V為樣液最終定容體積/mL；m為試樣溶液所代表試樣質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 C0引入的不確定度u1（C）

C0的不確定度由2 個部分組成，一部分是由5 種標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度——吸收率擬合的直線求得C0時測量所產(chǎn)生的不確定度，另一部分是由標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成5 種質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液時對C0的測量帶來的不確定度。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度u（C-1）

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度分別取以上5 種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL重復(fù)測定2 次，通過Excel軟件[25]得到相應(yīng)的色譜峰面積A，擬合而成的線性回歸方程為A=B1C＋B0（B0為截距，B1為斜率），測定數(shù)據(jù)及計算結(jié)果如表1所示。取一陽性樣品，進(jìn)行3 次重復(fù)檢測，其測定結(jié)果見表2，則由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度如式（2）所示：

式中：SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，計算方法為：B0=31 485；B1=4 191 749；P=3（對C0進(jìn)行3 次測量）；n=10（5個質(zhì)量濃度進(jìn)行2次測量，共2×5=10）；為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度，

帶入式（2），則u（C-1）=0.003 83 mg/L，

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table1 Analytical results of standard samples

表2 陽性樣品測量數(shù)據(jù)Table2 Analytical results of positive sample

2.1.2 由儲備液配制所產(chǎn)生的不確定度u（C-2）

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 mg/L）的不確定度稱取50.7 mg多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.6%），用甲苯定容至100 mL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)證書，多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品的純度誤差為±0.4%，按照均勻分布計算，由純度引起的不確定度和相對不確定度分別為：u（p）=0.4%/=0.231%；urel（p）=0.231%/98.6%=0.002 34。

據(jù)檢定證書，實(shí)驗(yàn)所用天平允許誤差為±0.1mg，按均勻分布計算，由稱量標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度和相對不確定度分別為：u（m1）=0.1/=0.057 8 mg；urel（m1）= u（m1）/m1=0.057 8/50.7=0.001 14。

100 mL容量瓶定容體積引入的不確定度[26]：A級單標(biāo)線100 mL容量瓶（V1）容量允許差是±0.1 mL，按矩形分布計算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：u（V1）=0.1/= 0.057 8 mL。實(shí)驗(yàn)室的溫度為（20±5）℃，甲苯的體積膨脹系數(shù)為1.12×10-3℃-1，故100 mL容量瓶由溫度引起的變化為±0.56 mL。假設(shè)溫度變化為均勻分布（k=），則u（V2）=0.56/=0.323 mL。如表3所示，合成100 mL容量瓶定容體積引入的相對不確定度為

表3 移液管和容量瓶引入的不確定度Table3 Uncertainty arising from pipettes and volumetric fl asks

2.1.3 母液稀釋過程產(chǎn)生的不確定度u（C-3）

1 mL多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500±1）mg/L移入10 mL容量瓶（A級）中，用甲苯定容至刻度，得到50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液（1∶10稀釋），2 mL多菌靈50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液移入100 mL容量瓶（A級）用甲苯定容至刻度，得到1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液（1∶50稀釋）。

式中：C1為1 mg/L的溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）；Cstock為儲備液質(zhì)量濃度/（mg/L）；f為稀釋因子，為稀釋前體積/mL；Vi為稀釋后體積/mL。

其中：

質(zhì)量濃度1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液為的不確定度u（1）由儲備液不確定度u（stock）和稀釋過程中的不確定度[u（1∶10）和u（1∶50）]組成。將儲備液的不確定度1 mg/L轉(zhuǎn)化成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，按均勻分布有0.577 mg/L，各項(xiàng)結(jié)果如表4所示。

表4 稀釋過程引入的不確定度Table4 Uncertainty arising from dilution

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程產(chǎn)生的不確定度u（C-4）

配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用1、2 mL和5 mL分度吸量管移取0.1、0.5 mL和1 mL，2mL和5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L）于一系列10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如表5所示。各稀釋過程產(chǎn)生的不確定度如表6所示。

表5 移液管和容量瓶引入的不確定度Table5 Uncertainty arising from pipettes and volumetric fl asks

表6 稀釋過程引入的不確定度Table6 Uncertainty arising from dilution

表7 大米中多菌靈含量測定結(jié)果Table7 Parallel measurements of carbendazim residues in rice

2.3 回收率產(chǎn)生的不確定度u（R）

測量回收率結(jié)果列于表7，按A類評定，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（R）=S（R）/= 0.209；urel（R）=u（R）/=0.209/83.69=0.002 47。

2.4 樣品稱質(zhì)量產(chǎn)生的不確定度u（m）

稱取10 g大米樣品，所用天平最大允許誤差為±0.01 g，按照矩形分布計算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：u（m）=0.01/=0.005 8 g；urel（m）= 0.005 8/10=0.000 58。

2.5 體積量取產(chǎn)生的不確定度u（V）

量取體積產(chǎn)生的不確定度主要由定容體積和進(jìn)樣體積不確定度組成，屬B類不確定度。

2.5.1 定容容量產(chǎn)生的不確定度

樣品經(jīng)過有萃取、凈化后用刻度試管定容至V1為1 mL，其體積允許誤差為±0.008 mL，按照矩形分布計算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：u（V1）=0.008/= 0.000 46 mL；因溫度變化產(chǎn)生的乙腈容積變化最大值為：u（V1溫）=1×5×1.37×10-3=0.006 85 mL，按照矩形分布計算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：u（V1溫）= 0.006 85/=0.003 95 mL。

定容時引入的不確定度為u（V1）==0.003 98；0.003 98。

2.5.2 LC-MS-MS聯(lián)用進(jìn)樣體積產(chǎn)生的不確定度

LC-MS-MS自動進(jìn)樣器配置的進(jìn)樣體積V2為5.0 μL，進(jìn)樣針容積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為±1%，按照矩形分布計算，則其相對不確定度urel（V2）=1%/=0.005 7。

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.7 相對擴(kuò)展不確定度

u（X）=urel（X）×X=0.034 8×0.033 5=0.001 1

2.8 不確定度分析結(jié)果

取包含因子k=2，多菌靈含量的擴(kuò)展不確定度U（u（X）×k）為0.002 2 mg/kg，故LC-MS-MS法測定大米中多菌靈含量的結(jié)果表示為（0.033 5±0.002 2）mg/kg，k=2。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)過程中，稱量、提取、凈化、MS測定等過程均會引入不確定度，本實(shí)驗(yàn)通過對實(shí)驗(yàn)室溫度、玻璃儀器、溶液配制、稀釋、重復(fù)測定、回收率、質(zhì)量、體積等因素的考慮，發(fā)現(xiàn)LC-MS-MS法測定糧谷中的多菌靈方法中，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定最大，其次為體積量取引入的不確定度分量。在日常檢查過程中，應(yīng)盡量保持LC-MS-MS儀器較高的靈敏度，并定期對所涉儀器進(jìn)行檢定和提高操作人員的熟練水平，從而減小測量不確定度。

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Uncertainty Evaluation for the Determination of Carbendazim in Rice by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LI Juying, HE Jian, KONG Deyang, SHAN Zhengjun*
(Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection of the People’s Republic of China, Nanjing 210042, China)

A methodology of uncertainty evaluation for the determination of carbendazim residues in rice by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS) was proposed. According to the Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement (JJF 1059-1999), the mathematical model of uncertainty was establis hed. The sources of uncertainty were analyzed and each component of uncertainty was quantifi ed individually and then combined. The results showed that the curve fi tting, preparation of standard solution and volumetric measurement were the main sources of uncertainty, and the expanded uncertainty was 0.002 2 mg/kg (k = 2), and the residue of carbendazim in rice was 0.033 5 mg/kg.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry; carbendazim; uncertainty; rice

O657.7

A

1002-6630（2015）22-0169-04

10.7506/spkx1002-6630-201522032

2015-03-03

李菊穎（1988—），女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥殘留檢測。E-mail：lijuying1988@126.com

*通信作者：單正軍（1963—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥及有機(jī)污染物對生態(tài)環(huán)境影響。E-mail：sszjnies@163.com