食品中蛋白質(zhì)測(cè)定方法的研究

曲 玲 汪海棠 徐學(xué)博 方 正 郭 佳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾 濱 150000）

蛋白質(zhì)是人體六大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，對(duì)于人體生長(zhǎng)需要具有重要的作用，人體攝入蛋白質(zhì)主要是食物中攝入，是人體氮源的唯一來(lái)源，是脂肪和糖類等人體其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法取代的。蛋白質(zhì)和人體的營(yíng)養(yǎng)代謝以及物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)息息相關(guān)。對(duì)蛋白質(zhì)的分離、定性定量分析在食品檢驗(yàn)中是非常重要的一項(xiàng)工作，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，分析檢驗(yàn)手段也在不斷進(jìn)步，對(duì)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法也在不斷向著準(zhǔn)確和快速的方向發(fā)展。食品中對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法主要分為直接測(cè)定和間接測(cè)定這兩大類。

1 凱氏定氮法

凱氏定氮法是食品工業(yè)中測(cè)定蛋白質(zhì)的最常用的一種方法，它屬于間接測(cè)定的一種方法，對(duì)食品式試樣中的總有機(jī)氮進(jìn)行測(cè)定，然后再根據(jù)含氮量推算出蛋白質(zhì)含量的一種方法。它是一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確率高的測(cè)定方法，是法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。運(yùn)用凱氏定氮法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定主要分對(duì)樣品進(jìn)行消化、蒸餾、吸收和滴定這四個(gè)過(guò)程。在催化劑的作用下，利用濃硫酸對(duì)試樣進(jìn)行消煮把試樣中的有機(jī)物破壞，使蛋白質(zhì)中的氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘睉B(tài)氮，氨態(tài)氮與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，利用強(qiáng)堿的作用進(jìn)行蒸餾使氨逸出，用硼酸把逸出的氨吸收再用酸進(jìn)行滴定，算出試樣中氮的含量，然后再乘以換算系數(shù)計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量?？墒沁@種方法需要的時(shí)間特別長(zhǎng)，而且還會(huì)產(chǎn)生有毒有害的氣體，所以要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨著科學(xué)的進(jìn)步，宗留香等人對(duì)傳統(tǒng)的測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)，利用Se作為催化劑來(lái)進(jìn)行消化過(guò)程，這樣就實(shí)現(xiàn)了環(huán)保消化，可以不用在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并且消化效率也得到了提高。

2 分光光度法

雙縮脲法是傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法。含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上的肽鍵與堿性的硫酸銅反應(yīng)形成紫色的絡(luò)合物，生成的顏色產(chǎn)物在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。把不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測(cè)試樣加入雙縮脲試劑，反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度測(cè)出的值對(duì)蛋白濃度作圖得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)于需要測(cè)定的試樣中蛋白質(zhì)的含量根據(jù)吸光度的值可以查出蛋白質(zhì)濃度。紫外光吸收法是以分子吸收光譜為基礎(chǔ)測(cè)定蛋白質(zhì)組成中含有的色氨酸、絡(luò)氨酸以及苯丙氨酸等芳香族氨基酸在紫外光280nm出最大吸收峰的一種測(cè)定方法?？墒呛怂嵩?60nm處有有光吸收，會(huì)對(duì)測(cè)定造成一定的干擾。考馬斯亮藍(lán)法另一種常用的光度法。考馬斯亮藍(lán)具有快速、穩(wěn)定與蛋白質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)，反應(yīng)進(jìn)行2分鐘左后就可以達(dá)到平衡，并且它的結(jié)合物在室溫下可以在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，它是目前靈敏度最高的一種測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可以達(dá)到1ug，并且這種方法操作起來(lái)也比較簡(jiǎn)單，所用的試劑也比較少，所用到的顯色劑的配制方法也比較簡(jiǎn)單，干擾物質(zhì)少，緩沖液還原劑、糖等都不會(huì)對(duì)顯色造成影響。近幾年利用金屬離子與有機(jī)染料形成配合物結(jié)合光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量得到了發(fā)展。金屬離子與有機(jī)染料相遇形成穩(wěn)定配合體系，在酸性條件下，遇到蛋白質(zhì)分子，互相極化形成新的大分子團(tuán)，從而定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。這種方法靈敏度高，干擾離子少，操作起來(lái)也比較簡(jiǎn)單。

3 電泳法

電泳是指在電場(chǎng)的作用下，帶電粒子向電荷相反的電荷的移動(dòng)的現(xiàn)象，對(duì)于蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離時(shí)一種重要的分離純化技術(shù)，主要有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和淀粉凝膠電泳等。在測(cè)定過(guò)程中對(duì)樣品的制備是最為關(guān)鍵的步驟，要最大限度的獲得所有的蛋白質(zhì)。在合適的鹽濃度下，要保持蛋白質(zhì)的最大溶解度和可重復(fù)性，要選擇合適的表面活性劑和還原劑，才能把所有的共價(jià)鍵二硫鍵都進(jìn)行破環(huán)，形成一個(gè)各自多肽的溶液，要把多糖、核酸以及脂類等干擾分子都盡量去除。這種方法的缺點(diǎn)就是所有的試劑多為有害試劑，會(huì)對(duì)人體健康造成傷害。唐萍等運(yùn)用毛細(xì)管電泳法測(cè)定奶制品中的蛋白質(zhì)含量，采用檸檬酸體系對(duì)牛奶中蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，采用涂層毛細(xì)管柱，在一定的條件下，對(duì)樣品緩沖液稀釋的奶制品在20分鐘內(nèi)得到了很好地分離。這種方法準(zhǔn)確快速，并且沒(méi)有污染，為奶粉的配方改善以及牛奶質(zhì)量監(jiān)控提供了一個(gè)新的途徑。

4 高效液相色譜法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

高效液相色譜法就是把蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，然后用高效液相色譜法測(cè)定每一種氨基酸的組成以及含量，然后就可以推算出試樣中蛋白質(zhì)的含量了。這種方法的特點(diǎn)就是會(huì)受到游離氨基酸的干擾。通過(guò)堿水解反應(yīng)、酸水解反應(yīng)以及酶水解反應(yīng)可以準(zhǔn)確的測(cè)定食物中蛋白質(zhì)的總氨基酸，通常情況下，在進(jìn)行酸水解后試樣中的氨基酸回收率高達(dá)95%。氨基酸在通過(guò)柱前或者柱后衍生后，用高效液相色譜檢測(cè)可以得到很高的靈敏度。利用這種方法的特點(diǎn)就是成本比較高，因?yàn)閮x器是比較昂貴的。由于這種方法主要是由儀器來(lái)測(cè)定的，所以很好地減少了認(rèn)為誤差，因此，它具有可靠和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，所以利用高效液相色譜法來(lái)測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)將會(huì)被更多的人采用。

結(jié)語(yǔ)

目前食品行業(yè)中測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法主要有凱氏定氮法、分光光度法、電泳法和高效液相色譜法，最準(zhǔn)確的測(cè)定方法為高效液相色譜法，運(yùn)用最廣泛的為凱氏定氮法，隨著科學(xué)的進(jìn)步，對(duì)于這幾種方法也在不斷改進(jìn)提高，以后將會(huì)出現(xiàn)更準(zhǔn)確、快捷的測(cè)定方法。但是食品安全問(wèn)題卻只能從源頭上解決，提高檢測(cè)水平完善檢測(cè)方法能有效地減少檢測(cè)的誤差卻不能保證食品的安全。

[1]王雅.蛋白質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)的研究[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2011，24（41）：58-59.

[2]鄧小超，呂愛(ài)娜，潘永麗.食品中蛋白質(zhì)測(cè)定方法的改進(jìn)[J].職業(yè)與健康，2011，21（36）：133-134.

[3]唐萍，田晶，佘振寶，等.奶制品中蛋白質(zhì)測(cè)定的毛細(xì)管電泳法研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，22（21）：15-18.