豬mtDNA及其在遺傳育種中的應(yīng)用

柴玉蘭，馬海明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128）

豬mtDNA及其在遺傳育種中的應(yīng)用

柴玉蘭*，馬海明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128）

自1962年線粒體DNA (mitochondrial DNA， mtDNA) 首次通過電子顯微鏡直接被觀察到以來，便成為核外遺傳物質(zhì)的研究熱點(diǎn)。隨著PCR、DNA測序、生物信息學(xué)等領(lǐng)域的快速發(fā)展，有關(guān)豬mtDNA的結(jié)構(gòu)、遺傳特點(diǎn)、應(yīng)用等各方面都已經(jīng)積累了相當(dāng)豐富的資料。豬線粒體DNA的長度約為16.7 kbp， 由1個(gè)非編碼D-Loop區(qū)和37個(gè)編碼基因組成，其結(jié)構(gòu)排列十分緊湊，堿基使用節(jié)約、高效。mtDNA具有母系遺傳、自主遺傳、無組織特異性、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，因此它在遺傳多樣性、起源進(jìn)化、生產(chǎn)性能、繁殖性能、豬肉真?zhèn)舞b別等方面被廣泛地研究、應(yīng)用。

1 特征

1.1 豬mtDNA的結(jié)構(gòu)、大小

mtDNA由重鏈（H strand，H鏈）和輕鏈（L strand，L鏈）兩條鏈組成，呈雙鏈閉合環(huán)狀。1979年，人類線粒體基因組全部序列被測得后，其他哺乳動(dòng)物的線粒體基因組全部序列也被先后測定。就豬的mtDNA而言，很多種豬種（如巴馬香豬、萊蕪黑豬、桃源黑豬、寧鄉(xiāng)豬、滇南小耳豬、榮昌豬、大圍子豬等等）mtDNA的全序列已被測出。豬mtDNA結(jié)構(gòu)現(xiàn)已十分清楚，它是由1個(gè)非編碼D-Loop區(qū) (D-Loop region，又叫非控制區(qū)non-coding control region)和37個(gè)編碼基因組成。而37個(gè)編碼基因中，包含2個(gè)核糖體RNA (12S rRNA和16S rRNA)，13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因 ( PCGs) 和22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA)。以大圍子豬mtDNA為例（表1）可以看出，豬mtDNA基因的結(jié)構(gòu)排列十分緊湊，無內(nèi)含子，基因間隔小，甚至閱讀框有交疊讀取的情況；堿基使用節(jié)約、高效，這些特點(diǎn)適應(yīng)于細(xì)胞器的快速復(fù)制。

1.2 豬mtDNA的遺傳特點(diǎn)

1.2.1 母系遺傳

在生殖過程中，mtDNA通過豬卵細(xì)胞質(zhì)傳遞給后代，不受公畜影響。雖然精子的少量線粒體會(huì)進(jìn)入卵母細(xì)胞，但由于胚胎中存在一對精源線粒體的識(shí)別和降解系統(tǒng)，它們在胚胎發(fā)生早期就消失了。這種幾乎無基因重組、嚴(yán)格的母系遺傳方式，為母系起源、親緣關(guān)系等群體分析奠定了理論基礎(chǔ)。

1.2.2 自主遺傳

mtDNA能完成自我復(fù)制，能自主轉(zhuǎn)錄生成RNA，并編碼合成部分維持自身結(jié)構(gòu)、功能所需的蛋白質(zhì)，其遺傳具有很大的自主性。值得提出的是，mtDNA的遺傳也會(huì)受到核DNA的調(diào)控，主要通過向線粒體輸入核DNA編碼的蛋白質(zhì)以及某些小RNA來實(shí)現(xiàn)。

1.2.3 組織特異性

細(xì)胞中mtDNA含量豐富，在同一個(gè)體中，不同組織中的mtDNA具有高度的均一性，即無組織特異性。但不同組織中的mtDNA的含量、斷裂程度不相同，因此不同組織中mtDNA提取的難易程度有所不同。實(shí)驗(yàn)證明，從肝臟提取mtDNA難度最小。

1.2.4 進(jìn)化速率

mtDNA的進(jìn)化非常快，其進(jìn)化速率是染色體基因組進(jìn)化速率的5～10倍。其主要原因，一方面在于mtDNA幾乎沒有與之相結(jié)合的組蛋白，處于“裸露”狀態(tài)，因而容易受到代謝產(chǎn)生的自由基、氧化物等中間物質(zhì)的誘變或損傷；另一方面，線粒體中缺乏防止DNA復(fù)制錯(cuò)誤和修復(fù)DNA損傷的酶，這都使mtDNA突變的可能性增加。同時(shí)，又由于核DNA承擔(dān)了細(xì)胞生長發(fā)育和新陳代謝的核心功能，選擇壓力大，而mtDNA承擔(dān)的功能少許多，選擇壓力較小，因此mtDNA的一些突變易被保留下來。

2 在遺傳育種中的應(yīng)用

2.1 遺傳多樣性與豬種的起源、進(jìn)化

早在20世紀(jì)90年代，就通過研究江西省、浙江省等地的豬mtDNA多態(tài)性充分探究了中國地方豬種遺傳多樣性。到目前，對中國地方豬種的起源分化基本已經(jīng)達(dá)成以下共識(shí)：中國地方豬種遺傳多樣性貧乏。

盡管各豬種的外表特征差異明顯，但是它們的mtDNA在遺傳結(jié)構(gòu)上沒有太大差異，這反映了它們母系起源上的一致性。的確，大多數(shù)研究表明，中國地方豬種都起源于亞洲野豬，亞洲野豬與歐洲野豬的進(jìn)化、馴養(yǎng)相對獨(dú)立。但此結(jié)論也存在爭議，有研究指出琉球野豬、華北野豬的幾種單元型與亞洲家豬間并無直接聯(lián)系；而Souza等通過分析線粒體Cytb基因表明本地主要豬品種起源于2 個(gè)不同的歐洲母系支系。

2.2 豬的繁殖、育種

線粒體在體內(nèi)處于新陳代謝和能量轉(zhuǎn)換的中心地位， 可產(chǎn)生體內(nèi)約85%的 ATP，線粒體的能量傳遞能力可能受mtDNA的調(diào)控。S.K.Lee等的研究指出，線粒體的代謝活性和mtDNA的復(fù)制對豬卵母細(xì)胞的發(fā)育有重要影響。另有報(bào)道指出mtDNA 拷貝數(shù)的減少和轉(zhuǎn)錄水平的降低都可以影響呼吸鏈功能、ATP的產(chǎn)生，而ATP可以影響卵子的正常發(fā)育、成熟；其次，卵母細(xì)胞的ATP含量直接影響受精率，ATP含量過高或過低都可以引起受精的失敗；再次， 由于在胚胎發(fā)育的早期， 受精卵基因組尚未激活， 胚胎發(fā)育所需的能量供給及調(diào)控因子都來自母源的基因表達(dá)產(chǎn)物， 故其所有耗能主要依賴卵母細(xì)胞所攜帶的線粒體。Hongshan Ge等的研究進(jìn)一步指出，mt DNA 拷貝數(shù)的減少，主要影響的是胚胎的發(fā)育潛力，而對卵母細(xì)胞成熟和體外受精影響相對較小。

表1 大圍子豬mtDNA的結(jié)構(gòu)

在mtDNA標(biāo)記輔助育種方面，趙興波等通過 PCR-RFLP方法研究豬mtDNA D-loop區(qū)，結(jié)果表明太湖豬、大白豬、北京黑豬、香豬、五指山豬、長白豬和杜洛克豬7個(gè)豬品種Acc Ⅳ 酶切位點(diǎn)的多態(tài)與太湖豬的高繁殖性能沒有直接的關(guān)系。

2.3 豬生產(chǎn)性能

Toelle等研究了杜洛克豬和大白豬的2個(gè)母系豬種的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)，其研究結(jié)果表明細(xì)胞質(zhì)對出生重、斷奶重和背膘厚度都有較大的意義，據(jù)此得出豬mtDNA與生產(chǎn)性能密切相關(guān)的結(jié)論。

2.4 豬肉真?zhèn)舞b別

豬肉真實(shí)性檢測關(guān)系到經(jīng)濟(jì)、宗教、食品安全或公共健康問題。自從2001年，BellagambaF利用 mtDNA的cytb基因產(chǎn)生的限制性位點(diǎn)成功鑒定出飼料中所使用的動(dòng)物性脂肪的動(dòng)物品種。近年來，基于mtDNA，在分子水平開發(fā)出了便宜、高效、靈敏、快捷的豬肉實(shí)驗(yàn)室常規(guī)鑒定方法。

2012年，Haider等開發(fā)了基于線粒體細(xì)胞色素c 氧化酶亞基1基因 （COI）的PCR-RFLP方法，可以把豬肉從牛、雞、火雞、羊、水牛、駱駝和驢的生肉樣品區(qū)分開。

2013年，陳睿賾根據(jù)mtDNA確定了4對引物，建立了一種能夠一次性快速區(qū)分出綿羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉的多重PCR檢測方法，即使100 ℃沸水中將樣品煮熟10 min，對mtDNA不會(huì)造成大的損傷，此方法依然靈敏。同年，Karabasanavar等根據(jù)豬線粒體D-loop區(qū)引物，建立了高度特異性的PCR豬肉鑒定方法，實(shí)現(xiàn)豬組織的精確檢測。該方法可使豬組織區(qū)別于其他24種動(dòng)物 (其中包含哺乳類、 鳥類、 嚙齒類動(dòng)物和魚類)，靈敏度可達(dá)0.1%，這項(xiàng)技術(shù)可以用于檢測生豬肉、 加工豬肉中是否有摻假肉。

3 問題與展望

目前，mtDNA在豬繁殖性能、生產(chǎn)性能方面的研究比較少。趙興波等雖然提出了7個(gè)豬品種Acc Ⅳ 酶切位點(diǎn)的多態(tài)與太湖豬的高繁殖性能沒有直接關(guān)系的論點(diǎn)，但是，這個(gè)試驗(yàn)的樣本量比較小（每個(gè)豬種只有12個(gè)樣本），因此該論點(diǎn)局限性較大，尚不能確認(rèn)該位點(diǎn)變異是否就只存在于長白豬和部分大約克豬品種上。所以，充分利用豬mtDNA， 找到更多符合人類生產(chǎn)需求的有利基因，選育出更符合社會(huì)需要的品種，是我們現(xiàn)在面臨的挑戰(zhàn)。

略。

2015-07-07)

863項(xiàng)目（2011AA100304），湖南省自然科學(xué)杰出青年基金（13JJ1021）

柴玉蘭（1989-），女，漢族，湖南益陽人，在讀碩士，研究方向?yàn)樨i的分子遺傳。

馬海明，教授，博導(dǎo)，E-mail: mahaiming2000@163.com