高偉　陸靜梅　牛陸　吳東梅　李巖　段肖

摘要：以耐鹽型的通榆野生大豆和鹽敏感型的輝南野生大豆植物葉片為試材，應(yīng)用石蠟切片和植紋鑒定技術(shù)，對(duì)不同生態(tài)環(huán)境野生大豆葉片的解剖結(jié)構(gòu)和表觀植紋進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，不同生態(tài)環(huán)境野生大豆葉片解剖結(jié)構(gòu)存在明顯差異，通榆野生大豆相對(duì)于輝南野生大豆葉片表皮細(xì)胞排列整齊，外切向壁角質(zhì)層較厚，孔下室不明顯，機(jī)械組織發(fā)達(dá)，柵欄組織較厚，平脈葉肉細(xì)胞多，主脈維管束導(dǎo)管分子較多，且出現(xiàn)異形維管束。植紋鑒定結(jié)果表明，盡管不同生態(tài)環(huán)境生長(zhǎng)的野生大豆具有很高的同源相似性，但數(shù)理統(tǒng)計(jì)后的植紋特征顯示出通榆野生大豆表觀結(jié)構(gòu)植紋更進(jìn)化。通榆野生大豆具有拮抗鹽逆境的演化結(jié)構(gòu)。野生大豆植紋鑒定結(jié)果可為鑒別同屬以及不同品系的同種植物提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：野生大豆（Glycine soja）；石蠟切片；植紋；相關(guān)性；回歸方程

中圖分類號(hào)： S565.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0131-03

大豆原產(chǎn)于中國(guó)，是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一。近年來(lái)，越來(lái)越多的科技工作者投身于大豆脅迫生理[1]、分子育種[2]等研究中來(lái)，但關(guān)于大豆解剖結(jié)構(gòu)的研究相對(duì)較少，尤其將解剖結(jié)構(gòu)和表觀結(jié)構(gòu)綜合起來(lái)的研究更是鮮有發(fā)現(xiàn)。植物解剖結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定保守的特性[3]，以結(jié)構(gòu)植物學(xué)的手段研究植物演化等問(wèn)題是十分科學(xué)且必要的。植物葉片作為主要的營(yíng)養(yǎng)器官直接影響著植物的生長(zhǎng)，比根、莖等器官對(duì)不同環(huán)境的變化更為敏感，且會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的演化[4]。研究植物葉片的解剖以及表觀結(jié)構(gòu)能直接反映出該種植物適應(yīng)不同環(huán)境所演化出的特征結(jié)構(gòu)。本研究基于石蠟切片和植紋鑒定技術(shù)[5]，試圖通過(guò)不同環(huán)境野生大豆葉片解剖和表觀結(jié)構(gòu)的差異，找到不同環(huán)境野生大豆植物結(jié)構(gòu)的演化規(guī)律，旨在為我國(guó)大豆屬植物拮抗逆境研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的野生大豆，分別為耐鹽型的通榆野生大豆和鹽敏感型的輝南野生大豆，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆種質(zhì)資源室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 石蠟切片方法 將供試材料放入FAA[甲醛 ∶ 冰乙酸 ∶ 乙醇（50%）= 1 ∶ 1 ∶ 18]中固定48 h后→乙醇梯度脫水→二甲苯梯度透明→浸蠟→包埋→切片→展片→二甲苯梯度脫蠟→番紅-亮綠復(fù)染法染色→中性樹(shù)膠（本試驗(yàn)采用加拿大樹(shù)膠）封片[6]。

1.2.2 植紋鑒定方法 將供試葉片放入FAA中固定48 h后，刮取其下表皮使其成為半透明的膜狀體，經(jīng)乙醇梯度脫水后用二甲苯?jīng)_洗，最后用中性樹(shù)膠封片制成永久裝片[5]。

1.2.3 數(shù)據(jù)測(cè)定及分析 各試驗(yàn)裝片均在Nikon Eclipse 80i顯微鏡下觀察，并在選取合適的視野后進(jìn)行顯微拍攝。采用Nis-Elements圖像分析系統(tǒng)中的Nis-Elements D 2.20，sp2（Build 243）Imaging Software軟件測(cè)量葉片的各特征參數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果為5次重復(fù)試驗(yàn)平均值，結(jié)果用“x±s”表示。運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生態(tài)環(huán)境野生大豆葉片解剖結(jié)構(gòu)比較

從表1、圖1、圖2看出，通榆野生大豆葉片厚度大于輝南野生大豆；通榆野生大豆葉片表皮細(xì)胞排列整齊，多呈長(zhǎng)方形、圓形，外切向壁角質(zhì)層較厚，孔下室相對(duì)輝南野生大豆不明顯，且表皮細(xì)胞厚度大于輝南野生大豆；通榆野生大豆葉片機(jī)械組織相對(duì)輝南野生大豆更為發(fā)達(dá)；柵欄組織長(zhǎng)度也表現(xiàn)為通榆野生大豆更長(zhǎng)；平脈葉肉細(xì)胞數(shù)量通榆野生大豆葉片中更多；通榆野生大豆葉片主脈維管束有8列導(dǎo)管分子，維管束鞘細(xì)胞相對(duì)較大，且出現(xiàn)了異形維管束，輝南野生大豆葉片主脈維管束有5列導(dǎo)管分子，沒(méi)有出現(xiàn)異形維管束；在木質(zhì)部和韌皮部之間通榆野生大豆出現(xiàn)6團(tuán)小薄壁細(xì)胞群，輝南野生大豆只有2團(tuán)小薄壁細(xì)胞群。

2.2 不同生態(tài)環(huán)境野生大豆葉片植紋鑒定結(jié)果

2.2.1 植紋特征

2.2.1.1 植紋類型 光學(xué)顯微鏡下觀察分析后發(fā)現(xiàn)，供試的

2個(gè)野生大豆葉片表觀紋理表現(xiàn)為：與保衛(wèi)細(xì)胞的排列方向一致的2個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞，分別在保衛(wèi)細(xì)胞兩側(cè)并與其邊緣相連，且2個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞大小不等。從而推斷這種植紋類型為平列不等型[5]（圖3、圖4）。

2.2.1.2 表皮細(xì)胞垂周壁（徑向壁）式樣 Dilcher于1974年對(duì)植物表觀形態(tài)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并將表皮細(xì)胞垂周壁（徑向壁）試樣分為A～I(xiàn)型[7]。根據(jù)陸靜梅[5]的相關(guān)研究，有理由將供試的野生大豆葉片表皮細(xì)胞垂周壁式樣歸納為以A型為主（圖3、圖4）。

2.2.1.3 表皮及附屬物 對(duì)野生大豆表皮附屬物觀察發(fā)現(xiàn)，供試的野生大豆葉片表皮毛均為單細(xì)胞毛。

2.2.2 植紋特征的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在同倍數(shù)下（物鏡40×，目鏡10×）隨機(jī)選取10個(gè)完整視野，記錄每個(gè)視野的表皮細(xì)胞

數(shù)量和氣孔器數(shù)量，然后用10個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)量（E）和氣孔數(shù)量（S）計(jì)算氣孔指數(shù)（I），公式為：I=[S/（E+S）]×100。氣孔密度換算為每mm2內(nèi)的氣孔個(gè)數(shù)。

從表2可以看出，保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)、寬和保衛(wèi)細(xì)胞、副衛(wèi)細(xì)胞及表皮細(xì)胞周長(zhǎng)、面積等數(shù)據(jù)均顯示出輝南野生大豆較通榆野生大豆大。根據(jù)Conover關(guān)于保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度等級(jí)的參考標(biāo)準(zhǔn)[8]：小型（S） < 12 μm；中小型（MS） = 12～19 μm；中型（M）= 20～34 μm；大中型（ML） = 35～42 μm；大型（L） = 43～65 μm；非常大型（VL） > 65 μm。可以得出不同環(huán)境野生大豆植物保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度等級(jí)介于MS和M之間，且表現(xiàn)為輝南野生大豆保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度等級(jí)相對(duì)較高。

通榆野生大豆各植紋特征的相關(guān)分析結(jié)果見(jiàn)表3，其中保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)與保衛(wèi)細(xì)胞面積、附衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)、附衛(wèi)細(xì)胞面積、表皮細(xì)胞周長(zhǎng)、表皮細(xì)胞面積；保衛(wèi)細(xì)胞面積與附衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)、附衛(wèi)細(xì)胞面積、表皮細(xì)胞周長(zhǎng)、表皮細(xì)胞面積；附衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)與附衛(wèi)細(xì)胞面積、表皮細(xì)胞周長(zhǎng)、表皮細(xì)胞面積；附衛(wèi)細(xì)胞面積與表皮細(xì)胞周長(zhǎng)、表皮細(xì)胞面積；表皮細(xì)胞周長(zhǎng)與表皮細(xì)胞面積15對(duì)數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)均大于0，且均滿足P<0.01，差異極顯著，說(shuō)明組內(nèi)二者存在極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系。輝南野生大豆各植紋特征的相關(guān)分析結(jié)果見(jiàn)表4，各組數(shù)據(jù)間均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

對(duì)通榆野生大豆植紋特征參數(shù)，應(yīng)用逐步回歸法（stepwise），進(jìn)行保衛(wèi)細(xì)胞面積y對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)x1、保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)x2、保衛(wèi)細(xì)胞寬x3的多元線性回歸分析。結(jié)果表明，剔除2個(gè)不顯著的偏回歸系數(shù)對(duì)應(yīng)的自變量保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度（P=0.57>0.05）、保衛(wèi)細(xì)胞寬度（P=0.62>0.05）后，最優(yōu)方程為保衛(wèi)細(xì)胞面積y對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)x1：y=-10.25+2.24x1，回歸模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.73。應(yīng)用一元線性回歸建立副衛(wèi)細(xì)胞面積y對(duì)副衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)x的回歸方程：y=-449.79+8.24x，回歸模型的相關(guān)系數(shù)r=0.97。應(yīng)用一元線性回歸建立表皮細(xì)胞面積y對(duì)表皮細(xì)胞周長(zhǎng)x的回歸方程：y=24.97+6.13x，回歸模型的相關(guān)系數(shù)r=0.89。

對(duì)輝南野生大豆植紋特征參數(shù)，應(yīng)用逐步回歸法進(jìn)行保衛(wèi)細(xì)胞面積y對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)x1、保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)x2、保衛(wèi)細(xì)胞寬x3的多元線性回歸分析。結(jié)果表明，剔除2個(gè)不顯著的偏回歸系數(shù)對(duì)應(yīng)的自變量保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度（P=0.65>0.05）和保衛(wèi)細(xì)胞寬度（P=0.65>0.05）后，最優(yōu)方程為保衛(wèi)細(xì)胞面積y對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)x1：y=-43.55+2.86x1，回歸模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.71。應(yīng)用一元線性回歸建立副衛(wèi)細(xì)胞面積y對(duì)副衛(wèi)細(xì)胞周長(zhǎng)x的回歸方程：y=-533.01+8.93x，回歸模型的相關(guān)系數(shù)r=0.94。應(yīng)用一元線性回歸建立表皮細(xì)胞面積y對(duì)表皮細(xì)胞周長(zhǎng)x的回歸方程：y=-26.65+7.05x，回歸模型的相關(guān)系數(shù)r=0.87。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，通榆野生大豆表皮細(xì)胞排列整齊，外切向壁具有較厚的角質(zhì)層，有利于植物葉片對(duì)光的折射，防止灼傷。通榆野生大豆葉片孔下室不明顯，植紋數(shù)據(jù)表明，輝南野生大豆單個(gè)氣孔平均面積較大，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得出不同生態(tài)環(huán)境野生大豆氣孔密度存在顯著差異，經(jīng)計(jì)算單位面積內(nèi)氣孔總面積表現(xiàn)為通榆>輝南，通過(guò)增加氣孔數(shù)量增加葉片氣孔總面積，在不影響植物正常進(jìn)行生命活動(dòng)的情況下，避免過(guò)度蒸騰導(dǎo)致植物失水。發(fā)達(dá)的機(jī)械組織增大了通榆野生大豆的機(jī)械支撐能力。其葉片的柵欄組織較多，且富含大量葉綠體，具有更強(qiáng)的光合能力。主脈維管束中導(dǎo)管分子的數(shù)量表現(xiàn)為通榆野生大豆較多，出現(xiàn)異形維管束，且平脈葉肉細(xì)胞數(shù)量也較輝南野生大豆更多，這些特征反映出通榆野生大豆相對(duì)于輝南野生大豆具有更強(qiáng)的疏導(dǎo)能力。木質(zhì)部和韌皮部間小薄壁細(xì)胞群的出現(xiàn)擴(kuò)大了營(yíng)養(yǎng)吸收面積，小薄壁細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量，同樣表現(xiàn)為通榆野生大豆更具優(yōu)勢(shì)。不同生態(tài)環(huán)境野生大豆葉片表觀植紋特征無(wú)較大差異，驗(yàn)證了同屬植物的同源相似性。統(tǒng)計(jì)后的數(shù)據(jù)顯示出較大不同，相關(guān)性分析結(jié)果，通榆野生大豆各個(gè)植紋特征間存在極顯著相關(guān)性，而輝南野生大豆各個(gè)植紋特征間無(wú)顯著相關(guān)性。雖然不同生態(tài)環(huán)境野生大豆植紋特征參數(shù)間均可建立線性回歸方程，但結(jié)果顯示各線性回歸方程均表現(xiàn)為通榆野生大豆擬合度更高。從而得出通榆野生大豆表觀紋理的規(guī)律性更強(qiáng)，從簡(jiǎn)單到復(fù)雜，從無(wú)序到有序是進(jìn)化的特征。研究結(jié)果證實(shí)通榆野生大豆演化出了拮抗鹽逆境結(jié)構(gòu)，將更適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。

同屬植物的鑒別一直是植物分類的焦點(diǎn)，尤其是同種植物不同品系的區(qū)分更加容易混淆。野生大豆植紋鑒定結(jié)果顯示出同屬植物的同源相似性，統(tǒng)計(jì)后的植紋特征數(shù)據(jù)體現(xiàn)出同屬植物的表觀結(jié)構(gòu)植紋差異，即使是同種植物的不同品系，其統(tǒng)計(jì)后的植紋特征數(shù)據(jù)也必然存在差異。應(yīng)用植紋鑒定技術(shù)，可分別對(duì)植紋3個(gè)不同層次進(jìn)行鑒別區(qū)分，即：（1）植紋特征；（2）量化后各植紋特征均值；（3）各植紋特征間獨(dú)特的顯著相關(guān)性和最優(yōu)的回歸方程[10]。研究結(jié)果表明，植紋鑒定手段對(duì)鑒別同屬植物、不同品系的同種植物具有極高的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。有關(guān)大豆屬植物分類、演化等問(wèn)題還有待進(jìn)一步深入研究。

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