么宏偉，佟立君，付婷婷**，謝晨陽，吳洪軍，趙鳳臣，馮 磊，張學(xué)義

（1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081）

〈貯運加工〉

松茸濃縮口服液制備過程中醇溶性物質(zhì)的提取研究*

么宏偉1，佟立君2，付婷婷1**，謝晨陽1，吳洪軍1，趙鳳臣1，馮 磊2，張學(xué)義1

（1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081）

本實驗是松茸口服液制備醇溶性物質(zhì)提取部分。將超聲波輔助水提取和弱堿鹽溶液提取后的殘渣用乙醇溶液提取，以多酚和三萜的總提取率為檢測指標(biāo)，對提取的條件進行了探討。研究表明，提取的最優(yōu)工藝為乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取溫度70℃，在此條件下多酚和三萜的得率分別為1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

松茸；多酚；三萜

松茸Tricholoma matsutake(S.Ito et Imai)Sing.，又名松口蘑，與溫帶和寒溫帶的松林與櫟林共生生長，為共生菌[1]。野生松茸的生長環(huán)境極為苛刻，需要依賴柏樹、橡樹等闊葉林為其生長發(fā)育提供營養(yǎng)支持，才能形成健康的子實體[2-3]。松茸含有豐富的氨基酸、維生素、脂肪膳食纖維和多種活性酶，另含有3種珍貴的活性物質(zhì)，分別是雙鏈松茸多糖、松茸多肽和松茸醇[4-5]。松茸具很多保健功能，如提高免疫力、抗癌抗腫瘤、治療糖尿病及心血管疾病、抗衰老養(yǎng)顏和促腸胃保肝臟等[6-8]。本課題以新鮮松茸為原料，利用超聲波輔助水提、弱堿鹽溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的營養(yǎng)物質(zhì)，并制備成了松茸濃縮口服液。本試驗打破了松茸在傳統(tǒng)口服液中利用率低的局限性，通過改變提取方式，增加了松茸濃縮液的提取率，并結(jié)合口服液具有使用簡單、方便，便于保藏等優(yōu)勢，大大提高了松茸的利用價值與經(jīng)濟效益。其中采用醇提取法提取松茸中的多酚及三萜。在實驗中對乙醇濃度、提取時間、提取溫度三個因素進行正交試驗和分析，確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗所需松茸來自黑龍江省牡丹江市東寧縣。

1.2試驗試劑

檸檬酸、正丁醇、肉豆蔻酯、EDTA、檸檬酸鈉、纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、碳酸鈉、氯化鈉、95%乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、草酸、維生素C、偏磷酸、醋酸、氯酸銨、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、磷酸、沒食子酸、福林酚、熊果酸、香草醛、冰醋酸、高氯酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗儀器與設(shè)備

主要試驗儀器見表1。

表1 主要試驗儀器Tab.1 Main laboratory apparatus

1.4試驗方法

1.4.1 原材料預(yù)處理

選擇新鮮、無病殘、無蟲蛀的松茸，于清水中洗凈，瀝水。將松茸子實體進行切片處理，用電子天平稱重，加入20倍體積無菌蒸餾水，將切片后的松茸減壓浸漬在含有0.03%的檸檬酸、0.02%正丁醇與0.02%肉豆蔻酯的混合溶液中，減壓浸漬10 min。加入0.02%EDTA、0.2%檸檬酸鈉，用組織搗碎器將組織破壞。加入纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，按6.8 g·L-1加入，3種酶的比例為1∶1∶1.4。

1.4.2 醇溶液提取工藝的優(yōu)化

（1）醇溶液提取工藝的優(yōu)化

為得到松茸中的醇溶性成分，將超聲波輔助水提取和弱堿鹽溶液提取后的殘渣用乙醇溶液提取，以多酚和三萜的總提取率為檢測指標(biāo)。

以多酚和三萜的總提取率為檢測指標(biāo)，稱取超聲波輔助水提取和弱堿鹽溶液提取后的殘渣50 g，分別改變提取條件（乙醇濃度、提取時間和提取溫度）的三個因素，考察各因素對總提取率的影響，各因素水平設(shè)置如下：

乙醇濃度：50%、60%、70%、80%、90%；提取時間：30 min、60 min、90 min、120 min、150 min；提取溫度：50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。

在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上，運用L9（33）正交表，由乙醇濃度、提取時間、提取溫度作正交表，因素水平表如表2。

表2 醇溶液提取工藝的正交試驗Tab.2 Orthogonal experiment design of alcohol solution extraction

（2） 醇溶液物質(zhì)總得率的計算

多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用水溶解并定容至250 mL，得到0.1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于 100 mL容量瓶中，加入1 mL福林酚顯色劑，搖勻后再加入2 mL15%碳酸鈉溶液，定容至100 mL，室溫下反應(yīng)2 h后于760 nm處測吸光值，以沒食子酸濃度（μg·mL-1） 為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD760） 為縱坐標(biāo)，如圖1所示。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Polyphenols standard curve

多酚得率的計算：取1 mL提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中多酚的濃度，可計算多酚得率（P），公式為：

P=M1/M0×100%

式中：M1表示提取液中多酚質(zhì)量；M0表示松茸質(zhì)量。

三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品1.150 mg，溶于10 mL無水乙醇中，得0.115 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL試管中，水浴蒸干溶劑。分別向每支試管中加入5%香草醛-冰醋酸0.5 mL、高氯酸1 mL，密封。60℃水浴加熱15 min，取出置于冰水中冷卻。再向每支試管中加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻。于548 nm處測吸光值，以熊果酸質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD548）為縱坐標(biāo)，如圖2所示。

圖2 三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Triterpenoids standard curve

三萜得率的計算：取1 mL提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中多糖的濃度，可計算三萜得率（P1），公式為：

P1=M2/M0×100%

式中：M2表示提取液中三萜質(zhì)量；M0表示松茸質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1醇溶液提取最佳工藝的確定

2.1.1 乙醇濃度對醇溶性成分總得率的影響

在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，醇溶性物質(zhì)的得率也呈上升趨勢，說明乙醇濃度可以改變醇溶性物質(zhì)的得率。結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對醇溶性物質(zhì)總得率的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on the rate of alcoholsoluble substances gotta

由圖3可知，醇溶性成分的總得率在乙醇濃度為80%時達到最大。乙醇濃度小時，松茸中的醇溶性物質(zhì)并沒有完全溶解到溶液中；而乙醇濃度大時可能會導(dǎo)致醇溶性成分結(jié)構(gòu)破壞或物質(zhì)變性影響得率。所以，以乙醇濃度80%為宜。

2.1.2 提取時間對醇溶性成分總得率的影響

提取時間會對醇溶性物質(zhì)的得率產(chǎn)生影響，提取時間過長，會導(dǎo)致得率降低。結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對醇溶性物質(zhì)總得率的影響Fig.4 Extraction time on the overall yield of the alcohol-soluble substances

由圖4可知，醇溶性成分的總得率在提取時間為60 min時達到最大。提取時間少時，不能將松茸中的醇溶性物質(zhì)完全提取出來；而提取時間多時可能會導(dǎo)致醇溶性成分結(jié)構(gòu)破壞影響得率。所以，以提取時間60 min為宜。

2.1.3 提取溫度對醇溶性成分總得率的影響

溫度可能會對醇溶液提取過程中乙醇的揮發(fā)及醇溶性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取溫度對醇溶性物質(zhì)總得率的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction of alcohol-soluble substances gotta rate

由圖5可知，隨著提取溫度的變化，醇溶性成分的總得率變化不大，在70℃時達到最大。所以，以提取溫度70℃為宜。

2.1.4 醇溶液提取工藝正交試驗

醇溶液提取總提取率正交設(shè)計試驗因素水平表及方差分析表見表3、表4。

表3 醇溶液提取總提取率正交設(shè)計試驗因素水平表Tab.3 Alcohol solution to extract total extraction rate orthogonal design factor level

表4 醇溶液提取總提取率方差分析表Tab.4 Alcohol solution to extract total extraction rate analysis ofvariance table

通過極差分析，得到因素顯著性主次順序為提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度。比較試驗結(jié)果可以得出三因素的最佳組成為：乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取溫度70℃。表4的方差分析結(jié)果表明，提取時間對乙醇溶液提取的影響達到顯著水平（p＜0.05）。

在最佳工藝條件下測得乙醇提取液中多酚和三萜的得率分別為1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

醇溶液提取的最佳工藝為：乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取溫度70℃。

3 小結(jié)

松茸中的醇溶性成分（多酚和三萜）最佳提取工藝為乙醇濃度80%，提取時間30 min，提取溫度70℃，此時多酚和三萜的得率分別為1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

[1]Byeon SE,Lee J,Lee E,et al.Functional activation of macrophages,monocytes and splenic lymphocytes by polysaccharide fraction from Tricholoma matsutake[J].Archives of Pharmacal Research,2009,32(11):1565-1572.

[2]Ding X,Tang J,Cao M,et al.Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Tricholoma matsutake [J].International Journal of Biological Macromolecules,2010,47(2):271-275.

[3]Kim SS,Lee JS.Process development formycelial growth and polysaccharide production in Tricholoma matsutake liquid culture[J].Journal of Bioscienceand Bioengineering,2010(3): 351-355.

[4]Yin XL,You QH.Immunomodulatory activities of different solvent extracts from Tricholoma matsutake(S.Ito et S.Imai) Singer(Higherbasidiomycetes)on normal mice[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2012(14):547-554. [5]You QH,Yin XL.Pulsed counter-current ultrasound-assistedextraction and characterization of polysaccharides from Boletus edulis[J].Carbohydrate Polymers,2014(101):379-385.

[6]You QH,Yin XL.Extraction purification and antioxidant activities of polysaccharides from Tricholoma mongolicum Imai [J].Carbohydrate Polymers,2014(99):1-10.

[7]You QH,Yin XL.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit of Cornus officinalis[J].Carbohydrate Polymers,2013(98):607-610.

[8]劉培貴，袁明生，王向華.松茸群生物資源及其合理利用與保護[J].自然資源學(xué)報，1999（3）：245-252.

Extraction of Alcohol-soluble Substances in the Process of the Preparation of Condensed Oral Liquid of Tricholoma matsutake

YAO Hong-wei1,TONG Li-jun2,FU Ting-ting1,XIE Chen-yang1, WU Hong-jun1,ZHAO Feng-chen1,FENG Lei1,ZHANG Xue-yi1
(1.Heilongjiang Forest By-Product and Speciality Research Institute,Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development,Mudanjiang 157011,China;2.Heilongjiang Academy of Forestry,Harbin 150081,China）

Extraction of alcohol-soluble substances was a part from preparation of condensed oral liquid of Tricholoma matsutake.The material which use alcohol solution to extract was the residue from water ultrasonic-assisted extraction and weak alkali salt extraction.The content of polyphenols,triterpenoids of Tricholoma matsutake were evaluated.The alcohol solution extraction technology were also discussed.The results showed that ethanol concentration was 80%,extraction time was 30 min and extraction temprature was 70℃,under the optimum conditions the content of polyphenols,triterpenoids were reached at 1.16 mg/100g and 0.23 g/100g.

Tricholoma matsutake;polyphenols;triterpenoids

S646.9

A

1003-8310（2015）02-0070-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.02.018

黑龍江省森林工業(yè)總局科技攻關(guān)項目（sgzjY2012022）。

么宏偉（1981-），男，在讀碩士研究生，助理研究員，主要研究方向為林產(chǎn)化學(xué)加工學(xué)。E-mail:meme917@163.com

**通信作者：付婷婷（1985-），女，碩士，研究實習(xí)員，主要從事林產(chǎn)化學(xué)加工學(xué)方面研究。E-mail:futingting115@126.com

2015-01-15