李文香，樊銘聰，張圣杰，胡欣蕾，孫亞男，陳相艷

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟南 250100）

金針菇多糖組成的探討與分析*

李文香1，2，樊銘聰1，2，張圣杰1，3，胡欣蕾1，2，孫亞男1，2，陳相艷3**

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟南 250100）

為探討金針菇多糖的組成，以金針菇子實體中分離純化得到的多糖為研究對象，采用DEAE Cellulose-52、高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）、PMP柱前衍生高效液相色譜法，分析了金針菇多糖的組成、分子量及單糖組分。結(jié)果表明，金針菇多糖由3種多糖組分組成，重均分子質(zhì)量分布分別為4 191 338、372 779、19 002，其中重均分子質(zhì)量最大的多糖組分為中性多糖，其余2種重均分子質(zhì)量較小的多糖組分為酸性多糖，且2種酸性多糖所占比例明顯大于中性多糖，分別占44.31%和37.76%，中性多糖僅占17.93%；金針菇多糖由葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、巖藻糖（Fuc）5種單糖組成，其中Glc含量比最高，其次是Gal和Man，Xyl和Fuc含量相對較低，5種單糖組成的摩爾比為13.05∶2.75∶3.16∶1.48∶1.00。由此可推斷，金針菇多糖可能是以葡聚糖為主，同時含有半乳糖聚糖、甘露聚糖、木糖聚糖或者巖藻聚糖等多個多糖組分構(gòu)成的混合多糖。

金針菇多糖；分子量；單糖組成

金針菇（Flammulina velutipes）被稱為“毛柄金錢菌”，俗稱“冬菇”、“樸菇”，在一些植物圖鑒上又稱作“樸蕈”。隸屬于真菌分類中的擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、金錢菌屬，其子實體是一種營養(yǎng)豐富，藥理作用廣泛的藥食兩用真菌[1]。

多糖是糖天然存在的重要形式，一般指由10個以上單糖基通過糖苷鍵連接而成，包括結(jié)構(gòu)多糖、儲存多糖和生物活性多糖。生物活性多糖由于具有多種重要生物活性，目前在功能性食品、生物醫(yī)藥、生物材料等許多領(lǐng)域中的發(fā)展和應(yīng)用日新月異[2]。生物活性多糖通常由幾百至幾千個單聚糖聚合而成，其性質(zhì)已完全不同于單糖，無甜味，且強還原性消失，而且多糖的生物活性與其單糖組成、分子量及其結(jié)構(gòu)等密切相關(guān)[3-4]。金針菇多糖 (Flammulina velutipes Polysaccharides，F(xiàn)VP)是金針菇中含量最為豐富的生物活性成分，具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝及增強記憶等多方面作用[5-6]，已成為食品科學(xué)、天然產(chǎn)物、生物化學(xué)與生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點[7-8]。對金針菇多糖的研究，多數(shù)是圍繞多糖提取工藝的優(yōu)化及其粗多糖各種生物活性方面進行探討，而對金針菇多糖的純化及其組成的分析研究尚不夠深入[9]。

近年來，金針菇工廠化生產(chǎn)發(fā)展十分迅速，其產(chǎn)量和人均消費數(shù)量均僅次于雙孢蘑菇和香菇，列第三大食用菌[10]。當(dāng)前，金針菇主要以鮮銷為主，其深加工品種尚不多見。為促進金針菇產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)穩(wěn)步發(fā)展，提高金針菇的產(chǎn)后附加值，推動金針菇產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級，加快金針菇功能性保健食品的研發(fā)進程，本文在前期探討超聲聯(lián)合超微粉碎法提取金針菇多糖的基礎(chǔ)上[11]，利用從金針菇子實體中分離純化得到的多糖為研究對象，通過采用合理的技術(shù)手段對金針菇多糖的組成、分子量及單糖組分進行分析探討，以期為金針菇子實體多糖的高效利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器

金針菇，濟南市濟陽金寶金針菇種植合作社提供。

試劑：無水乙醇、正丁醇、丙酮、活性炭（分析純，天津市科密歐）；氯仿（化學(xué)純，天津市科密歐）；木瓜蛋白酶、DEAE Cellulose-52（Pharmacia）、葡聚糖標準品（Sigma）、純度99%1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、98%木糖、98%氨基葡萄糖、99%氨基半乳糖（Acros Organics）、HPLC級乙腈（Tedia）；≥99%三氟乙酸（國藥集團）；單糖標準品：99%葡萄糖、99%甘露糖、≥99%半乳糖（上?；瘜W(xué)試劑公司）、≥99%鼠李糖、≥99%巖藻糖、≥99%葡萄糖醛酸、≥97%半乳糖醛酸（Sigma-Aldrich）；99%核糖、99%阿拉伯糖（廈門星隆達生化試劑）；超純水；其它試劑均為分析純。

主要實驗儀器：UV-160紫外分光光度計（日本島津）；電子天平（上海奧豪斯）；XO-SM100超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)（南京先歐）；LXJ-IIB高速離心機（上海安亭）；DHG電熱恒溫干燥箱、DK-8D電熱恒溫水槽（上海精宏）；FDV氣引式超微粉碎機（臺灣弘荃機械）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化）；8 kD透析袋（美國光譜醫(yī)學(xué)公司）；HL-2恒流泵、TH-500梯度混合器、BS-100A自動部份收集器、1.6 cm×40 cm層析柱（上海滬西儀器廠）；Waters600高效液相色譜儀（2140示差折光檢測器，Empower工作站）；Agilent1100高效液相色譜儀（G1311A四元泵、G1315BDAD檢測器、G1313A自動進樣器、G1379A在線脫氣機、G1316A柱溫箱、Agilent1100化學(xué)工作站）。

1.2試驗方法

1.2.1 金針菇多糖的分離純化工藝

篩選金針菇切段置于通風(fēng)處風(fēng)干，然后平鋪于紗布上，于60℃烘箱中烘干至恒重，經(jīng)超微粉碎后過300目篩備用，按照1∶25的料液比，加入蒸餾水進行浸提，4 500 r·min-1離心20 min[12-13]，取上清液濃縮3倍，80%乙醇濃度醇沉，離心保留多糖，多糖溶解，木瓜蛋白酶聯(lián)合Sevage法脫蛋白，1.5%活性炭用量在50℃下脫色40 min，濃縮，8 kD透析，透析液備用[14-15]。

1.2.2 金針菇多糖DEAE Cellulose-52柱層析測定

（1）制備

取適量DEAE Cellulose-52于燒杯中，加入蒸餾水浸泡48 h，抽濾到基本無水再加入0.5 mol·L-1HCl，薄膜封口繼續(xù)浸泡2 h，同樣洗至中性再次抽濾至基本無水，再加入0.5 mol·L-1NaOH，薄膜封口繼續(xù)浸泡2 h，同樣洗至中性并抽干即可。將 1.6 cm×40 cm的層析柱垂直固定在鐵架臺上，用蒸餾水洗瓶排氣清洗。將提前處理好的DEAE Cellulose-52用玻璃棒攪拌均勻，通過玻璃棒引流連續(xù)緩慢灌入柱中，當(dāng)沉降高度達到柱高的1/4～1/3時可以打開柱下端使其溶劑緩慢流出，最終沉降到需要的高度。灌柱中，始終保持吸附劑浸泡在溶劑內(nèi)，避免起泡。

（2）上樣

分離組分的濃度與其對交換劑的親和力是上樣主要考慮的因素。根據(jù)實際經(jīng)驗，當(dāng)為分析柱時，上樣體積小于柱床體積的5%。本試驗使用1.6 cm× 40 cm的層析柱，有效柱長為30 cm，根據(jù)上述比例，床體積為60.23 mL，金針菇多糖溶液上樣體積為3 mL。

（3）洗脫

蒸餾水、0.1 mol·L-1、0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1NaCl溶液各120 mL（大約2倍柱體積），調(diào)整恒流泵，流速控制在2.6 mL·min-1，自動收集器每5.2 mL接一管，苯酚-硫酸法檢測繪制洗脫曲線。蒸餾水洗脫得中性多糖，鹽溶液洗脫得酸性多糖。

1.2.3 高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）

（1）色譜條件

色譜柱：Ultrahydrogel Linear 300 mm×7.8 mm，10 μm；流動相：0.1 mol·L-1硝酸鈉；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：45℃。

（2）樣品制備

稱取樣品100 mg于25 mL容量瓶中，用流動相溶解，定容。

（3）標準曲線制作

分別取Dextran T-5、Dextran T-10、DextranT-50、DextranT-150標準品溶液進樣。

1.2.4 PMP柱前衍生高效液相色譜法

（1）混合單糖標樣的衍生

配制各單糖質(zhì)量濃度均為0.36 g·L-1左右的混合單糖標準液與0.6 mol·L-1NaOH溶液，然后2種溶液各取100 μL于1 mL的具塞試管中混合均勻。配制0.5 mol·L-1的PMP（0.4355 g/5mL）甲醇溶液，取上述混合液與甲醇溶液各50 μL于5 mL的具塞試管中混勻；將烘箱升溫至70℃，然后將上述試管放入此烘箱進行反應(yīng)，時間大約為100 min，反應(yīng)完畢后取出室溫冷卻；此反應(yīng)液需加入50 μL 0.3 mol·L-1的HCl中和，中和后加水補至1 mL，混勻再加1 mL氯仿，震蕩靜置，將氯仿除去，重復(fù)操作3次。

（2）樣品制備

配制4 g·L-1～5 g·L-1質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液與4 mol·L-1TFA，各取100 μL于5 mL的具塞刻度試管中，充入N2封閉管口，將此管放在110℃烘箱水解2 h[16-18]；取出冷卻后加入200 μL甲醇，用N2吹干法去除TFA，重復(fù)此步驟3次。吹干后向試管中加入50 μL 0.13 mol·L-1NaOH溶液對殘存殘渣溶解，再將溶解液與50 μL 0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液充分混合，后續(xù)步驟同1.2.4（1）。

（3）液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol·L-1磷酸鹽（pH6.7） 緩沖液-乙腈（體積比為83∶17）；柱溫：30℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL·min-1；進樣體積：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1金針菇多糖梯度洗脫曲線

金針菇多糖的梯度洗脫曲線如圖1所示。

圖1 金針菇多糖洗脫曲線Fig.1 Elution curve of FVP

從圖1可以看出，DEAE Cellulose-52對金針菇多糖成分初步分離具有明顯的效果。40管之前由蒸餾水洗脫，得到一種中性多糖；41管開始用0.1 mol·L-1～0.5 mol·L-1NaCl進行洗脫，得到2個峰，洗脫得到的是酸性多糖。

2.2金針菇多糖組成及分子量的測定

葡聚糖標準曲線如圖2所示。

圖2 葡聚糖標準曲線Fig.2 The standard curve represented by dextran

由圖2可知，4種不同分子量的葡聚糖標準品的色譜峰保留時間tR分別為27.179 min、29.633 min、32.613 min、34.733 min。以色譜峰的保留時間tR對Lg（Mw） 進行回歸，得出回歸方程為：Lg（Mw）=-0.2253tR+11.279，R2=0.9948，具有較好的線性關(guān)系。

金針菇多糖的高效凝膠過濾色譜圖如圖3所示。

圖3 金針菇多糖高效凝膠過濾色譜圖Fig.3 The chromatogram of the FVP by HPGFC

從圖3可以看出，金針菇多糖的凝膠過濾色譜圖共顯示出3個峰，且每個峰基本對稱，表明該金針菇多糖中具有3種多糖組分。此結(jié)果與DEAE Cellulose-52所獲得的結(jié)果一致（圖1）。采用高效凝膠過濾色譜法 (HPGFC)進一步對金針菇多糖進行分析，結(jié)果見表1。

表1 金針菇多糖HPGFC分析結(jié)果Tab.1 Analytical results of the FVP by HPGFC

由表1可知，3個多糖組分中的保留時間tR分別為20.671 min、25.883 min、31.371 min，重均分子質(zhì)量分別為4 191 338Da、372 779Da、19 002 Da，峰面積分別為325 508、804 318、685 354。其中重均分子質(zhì)量較小的2個組分的峰面積所占的比例較大，分別為44.31%和37.76%，而最先出峰的重均分子質(zhì)量最大組分的峰面積只占17.93%。

2.3標準單糖樣品的液相色譜圖

將標準單糖樣品按“1.2.4（1）”中水解和衍生化及“1.2.4（3）”中的色譜條件測定，得到標準單糖樣品的液相色譜圖如圖4所示。

從圖4可見，不同標準單糖樣品在該色譜條件下可明顯分開。各標準單糖樣品的出峰時間見表2。

2.4金針菇多糖樣品的液相圖譜

金針菇多糖樣品按“1.2.4（2）”中水解和衍生化及“1.2.4（3）”中的色譜條件測定，測得純化后金針菇多糖其單糖組成的液相色譜圖如圖5所示。

圖4 標準單糖樣品液相色譜圖Fig.4 HPLC of the mixed standard monosacharides

表2 標準單糖樣品出峰時間Tab.2 The peak time of standard monosacharides

圖5 樣品的液相色譜圖Fig.5 HPLC of monosacharides of FVP

依據(jù)圖5，并對照表2可知，金針菇多糖的單糖組成主要包括葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、巖藻糖（Fuc）共5種單糖，同時還可能混有微量的半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸及氨基葡萄糖等。

進一步對金針菇多糖的單糖組成液相色譜圖（圖5）進行分析，并計算各不同組成單糖的摩爾比值，其結(jié)果見表3。

由表3可以看出，5種單糖的保留時間分別為15.606 min、31.450 min、35.824 min、38.519 min、46.821 min，對應(yīng)的出峰面積比分別為12.6717%、60.1374%、14.5636%、6.8099%、4.6069%，5種單糖組成的摩爾比為13.05∶2.75∶3.16∶1.48∶1.00；其中金針菇多糖的單糖組成中Glc含量比較高，其次是Gal和Man,而Fuc含量較低。由此可以推斷，金針菇多糖主要是由葡聚糖構(gòu)成，同時半乳糖聚糖、甘露聚糖、木糖聚糖或者巖藻聚糖等多個組分可能混在其中。

表3 金針菇多糖單糖組成及其摩爾比值Tab.3 Monosacharides of FVP and molar ratio

3 結(jié)論與討論

通過對金針菇子實體中分離純化得到的粗多糖，進行DEAE Cellulose-52柱層析分析，結(jié)果表明金針菇多糖由3個多糖組分組成；高效凝膠過濾色譜（HPGFC）測定的結(jié)果表明，金針菇多糖的3個多糖組分的重均分子質(zhì)量分別為4 191 338、372 779、19 002，其中重均分子質(zhì)量為4 191 338的多糖組分為中性多糖，其余2個組分為酸性多糖，2個酸性多組分所占比例較大，分別占總量的 44.31%和37.76%，而中性多糖組分僅占17.93%。

金針菇子實體多糖主要由Glc、Man、Gal、Xyl、Fuc五種單糖構(gòu)成。其中，金針菇多糖的單糖組成中Glc含量比較高，其次為是Gal和Man，F(xiàn)uc含量較低，5種單糖組成的摩爾比為13.05∶2.75∶3.16∶1.48∶1.00?？梢酝茢?，金針菇多糖可能是以葡聚糖為主，同時含有半乳糖聚糖、甘露聚糖、木糖聚糖或者巖藻聚糖等多個多糖組分構(gòu)成的混合多糖。

食用菌多糖是一種特殊的生物活性物質(zhì)，具有多種生物活性，幾乎無任何不良反應(yīng)，在國際上被稱為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[19]。傅明輝等[20]采用新鮮金針菇子實體勻漿后用熱水浸提、乙醇沉淀及Sevage法去蛋白，得到粗多糖經(jīng)DEAE Cellulose-52柱層析后獲得2個多糖組分A1和A2；而本研究在優(yōu)化了超聲聯(lián)合超微粉碎法提取金針菇多糖基礎(chǔ)上[11]，采用水提、醇沉及木瓜蛋白酶聯(lián)合Sevage法脫蛋白得到的金針菇子實體粗多糖，經(jīng)DEAE Cellulose-52柱層析分析獲得3個多糖組分。造成這種差異的原因，可能主要是由于柱層析過程中的洗脫工藝不同所致；但也可能與金針菇多糖提取過程中的前處理及蛋白脫除等工藝的不同有關(guān)。當(dāng)然，金針菇的品種及其產(chǎn)地等方面的不同也可能會導(dǎo)致其多糖組成的差異。

秦小明等[21]采用水提、醇沉及三氯乙酸法脫蛋白獲得金針菇子實體粗多糖，經(jīng)DEAE-Cellulose陰離子交換柱分析得到FVCP-A、FVCP-B和FVCP-C三個多糖組分，與本研究的結(jié)果相符。但本研究得到的3個金針菇多糖組分重均分子質(zhì)量分別為4 191 338、372 779、19 002，3個多糖組分所占比例分別為17.93%、44.31%、37.76%；其中，重均分子質(zhì)量最大的多糖組分為中性多糖，其余2種重均分子質(zhì)量較小的多糖組分為酸性多糖。而秦小明等[21]雖未進一步對3個多糖組分FVCP-A、FVCP-B和FVCP-C的分子質(zhì)量進行測定，但3個多糖組分的比例分別為35.8%、44.7%、16.5%。對比2個實驗的結(jié)果，盡管二者均從金針菇子實體粗多糖中分離得到3個多糖組分，但3個多糖組分所占的比例卻存在著明顯的差異。這可能是由于2種金針菇多糖雖然均采用水提、醇沉獲得，但因二者的前處理方法不同，導(dǎo)致所獲得的3個多糖組分其占的比例明顯不同。本研究得到的粗多糖中大分子多糖所占比例明顯較低，而小分子多糖所占的比例則比較高；而對方得到的粗多糖則不同，其大分子多糖所占比例偏高，小分子多糖所占的比例偏低。這可能主要是由于本研究在樣品前處理過程中，采用了超聲聯(lián)合超微粉碎的處理方法，使細胞破壁，這不僅有利于金針菇子實體中胞外大分子多糖的提取，同時也可有效提高其胞內(nèi)較小分子多糖的提??；而對方因樣品未進行超微粉碎及超聲處理，所提取的多糖可能是以分子質(zhì)量較大的胞外多糖為主，而小分子的胞內(nèi)多糖不易被提取出來的緣故。

有關(guān)金針菇多糖活性，除了與分子量、溶解度、粘度等物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)外，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)。因此，今后我們將進一步對金針菇多糖的一級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)進行研究，尤其是對分離得到2個酸性多糖組分的活性及其構(gòu)效關(guān)系進行深入探討，以期為推動金針菇產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，開辟金針菇多糖高效開發(fā)利用提供參考。

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書訊

《食用菌營養(yǎng)與烹飪》由湖南省食用菌研究所與中國食用菌協(xié)會、中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所共同編寫，主要包括毒菌類的識別方法、食用菌的選購與貯藏、食用菌的營養(yǎng)與保健作用、食用菌經(jīng)典菜式等內(nèi)容，重點介紹39種常見食用菌141個菜品的烹飪方法。烹飪方法結(jié)合了多地菜肴的特色，兼顧營養(yǎng)、口味、地域及燒、蒸、煮等各種制作技巧的使用，菜式豐富、搭配合理。內(nèi)容詳實、圖片精美，實用性強。

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《中國食用菌》編輯部

Discussion and Analysis on Flammulina velutipes Polysaccharides Compositions

LI Wen-xiang1,2,FAN Ming-cong1,2,ZHANG Sheng-jie1,3,HU Xin-lei1,2,SUN Ya-nan1,2,CHEN Xiang-yan3
(1.Food Science and Engineering College,Qingdao Agricuitural University,Qingdao 266109,China;2.Shandong Provincial Laboratory of Applied Mycology,Qingdao 266109,China;3.Institute of Agro-Food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Science,Jinan 250100,China)

The polysaccharides from the fruiting body of Flammulina velutipes were extacted to evaluated the polysaccharides composition,molecular weight and monosaccharide constituents,which analyzed by DEAE Cellulose-52,high gel filtration chromatography(HPGFC)and PMP-HPLC.The results showed that the Flammulina velutipes polysaccharide(FVP)was composed of three faction,whose molecular weight(Mw)were 4 191 338,372 779,19 002.Among the three fraction of FVP compositions,the higher molecular weight of FVP composition was neutral polysaccharide,the other two frations were acid polysaccharide,meanwhile,the content of two acid polysaccharide frations were higher than the neutral polysaccharide fraction with 44.31%,37.76%and 17.93%,respectively.The FVP was composed of Glc,Man,Gal,Xyl,Fuc,and the Glc content was the highest,followed by Gal and Man,then Xyl and Fuc content was lowest.The molar ratio was relatively 13.05∶2.75∶3.16∶1.48∶1.00.In conclsion,the FVP might be composed of glucan mainly,which mixed by some fractions,such as galactose glycan, mannan,xylan and fucosan.

Flammulina velutipes polysaccharide;molecular weight;monosaccharide constituent

S646.1

A

1003-8310（2015）02-0060-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.02.016

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)經(jīng)費資助（SDAIT-11-011-09）。

李文香（1963-），女，博士，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工方面研究。E-mail:xiang7332@126.com

**通信作者：陳相艷（1973-），女，碩士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工方面研究。E-mail:chenxy@saas.ac.cn

2014-12-16