魯云風，李慶崗，王志秀，張博，吳克亮，張浩*

（1.南陽師范學院生命科學與技術(shù)學院，河南南陽473061；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京100193；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

培育中的淮豬新品系ECI1基因多態(tài)性及其與背膘厚的相關(guān)性研究

魯云風1，2，李慶崗3，王志秀2，張博2，吳克亮2，張浩2*

（1.南陽師范學院生命科學與技術(shù)學院，河南南陽473061；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京100193；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

為分析ECI1基因多態(tài)性與背膘厚性狀的遺傳關(guān)系，采用PCR-RFLP技術(shù)，檢測286頭淮豬新品系Ⅱ系Ⅱ世代個體ECI1基因的遺傳變異，統(tǒng)計分析ECI1基因型與背膘厚性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：培育中的淮豬新品系豬群中存在豐富的ECI1基因多態(tài)性，CC型個體的活體背膘厚顯著高于TT型個體（P＜0.01），TC型個體處于中間。該研究進一步驗證了ECI1基因?qū)簇i新品系育肥性狀的影響效應(yīng)，為ECI1基因作為淮豬新品系的分子遺傳標記提供理論依據(jù)。

ECI1；背膘厚；淮豬新品系

提高肌內(nèi)脂肪含量和降低背膘厚被認為是提高肉質(zhì)性狀和豬育種規(guī)劃的重要目標［1-2］。豬的肉質(zhì)性狀屬于低遺傳力的數(shù)量性狀,常規(guī)的育種方法很難取得較大的遺傳進展,國內(nèi)外學者研究了一些控制該性狀的主效基因和QTL［3-5］用于分子輔助育種。脂肪尤其是動物體脂的沉積量是脂肪合成代謝與分解代謝的一種平衡狀態(tài),脂質(zhì)的沉積與代謝是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀,并且受制于脂肪合成與代謝平衡狀態(tài)［6］,脂肪酸則是脂質(zhì)合成和代謝的中間產(chǎn)物。?3-?2-烯酸-輔酶A異構(gòu)酶(ECI1)是參與β氧化過程中雙鍵新陳代謝所必須的輔酶［7］,在不飽和脂肪酸新陳代謝過程中起重要作用［8-9］,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ECI1基因在中國地方脂肪型豬背脂和背最長肌中表達量均顯著高于外來瘦肉型豬(數(shù)據(jù)未發(fā)表),表明其極有可能是調(diào)控豬脂肪代謝的主效基因。

培育中的淮豬新品系是以地方品種淮豬作第一母本,以長白和大約克分別為第一、第二父本進行雜交育種和橫交固定而成的新品系豬,含淮豬血統(tǒng)25%,長白血統(tǒng)25%,大約克血統(tǒng)50%,其背膘厚處于淮豬和引進品種(長白和大約克)之間［10-11］。

本文對培育中的淮豬新品系的脂肪性狀候選主效基因ECI1多態(tài)性進行檢測,分析ECI1基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀背膘厚的遺傳關(guān)系,為ECI1基因作為淮豬新品系的分子遺傳標記世代選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料以地方品種淮豬和長白豬作第一母本、第一父本,其后代母豬為第二母本,大約克為第二父本,所產(chǎn)后代為淮豬新品系零世代,在零世代的基礎(chǔ)上進行橫交固定,于2008年成功培育出淮豬新品系I系［10］?；簇i新品系豬群飼養(yǎng)在安徽省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所豬育種基地-科鑫公司豬場,采集Ⅱ系Ⅱ世代286頭母豬耳組織樣品,迅速放入裝有75%酒精的離心管中,實驗室冷凍保存,用于提取基因組DNA。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取采用苯酚-氯仿抽提法［12］,Naro Drop2000測定濃度,TE溶解,-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計合成根據(jù)前期克隆得到的豬ECI1基因序列(GenBank：KC447361.1)及在淮豬、大白豬群體中測序掃描得到的具多態(tài)性位點的SNP (intro3-C54T)設(shè)計引物,正向引物序列5′-GCTGCCTCCTCTCCCTCA-3′,反向引物序列5′-GGAACAGCCAGCCACTTG-3′,擴增區(qū)域為ECI1基因部分第2外顯子、第3內(nèi)含子及第3外顯子,片段大小為349 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10×Buffer 2 μL,dNTPs Mix(10 mmol/L)0.5 μL,10 μmol/L的雙向引物各0.5 μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL, DNA模板1 μL,加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸5 min。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切(RFLP)酶切反應(yīng)體系為20 μL,其中內(nèi)切酶Bsm I(美國NEB公司)0.4 μL (4 U),10×Buffer 2 μL,PCR產(chǎn)物10 μL,加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)溫度為37℃,酶切6 h。酶切后的片段經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄酶切結(jié)果。

1.2.5 背膘厚測定在生長性能測定結(jié)束時稱量試驗豬體重,采用A超(美國運高)測定膝關(guān)節(jié)前緣引線與背中線垂直相交(腰薦部)距背中線左側(cè)4 cm處的活體背膘厚［13-14］,按如下公式校正到90 kg活體背膘厚。

校正背膘厚=實測背膘厚×A÷{A+[B×(實測體重-90)]}。由于都是母豬,故A=13.706,B=0.119624。

1.2.6 統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件的一般線性模型(GLM)過程,對ECI1基因多態(tài)性與淮豬新品系母豬群體背膘厚的相關(guān)性進行最小二乘分析,模型為yi=u+ai+ei。其中,yi為個體性狀觀測值；u為群體均值；ai為基因型效應(yīng)值；ei為隨機殘差效應(yīng)。計算數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型分析PCR產(chǎn)物有1個BsmⅠ酶切位點,經(jīng)BsmⅠ限制性內(nèi)切酶酶切,出現(xiàn)3種帶型在瓊脂糖凝膠上顯示為3條帶(349 bp、195 bp和154 bp)的為TC基因型,2條帶(195 bp和154 bp)的為TT基因型,表明PCR擴增片段被BsmⅠ切開；未被BsmⅠ切開的為CC基因型。

圖1 淮豬新品系ECI1基因Bsm I酶切結(jié)果(部分)

2.2 ECI1位點多態(tài)性在淮豬新品系中的分布由表1可知,ECI1基因T等位基因頻率為0.661,為淮豬新品系的優(yōu)勢等位基因,由于淮豬新品系Ⅱ系正處于選育中,所以卡方檢驗該位點處于哈代溫伯格非平衡狀態(tài)(P＜0.05),TT基因型頻率為0.49,高于其他2種基因型。

表1 淮豬新品系II系(二世代)ECI1基因的基因頻率及基因型頻率分布

2.3 基因型與背膘厚的相關(guān)性分析ECI1基因CC型比TC、TT型個體的背膘厚分別高1.02、1.62 mm,分別達到顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)水平,而TC和TT基因間差異不顯著(P＞0.05),見表2。

表2 不同基因型淮豬背膘厚

3 討論

哺乳動物體內(nèi)1/2以上的脂肪酸為不飽和脂肪酸,需要?3-?2-烯酸-輔酶A異構(gòu)酶(ECI1)催化使其生成2-反烯脂酸輔酶A才進入下一步反應(yīng),因此豬體內(nèi)脂肪沉積很大程度上取決于ECI1基因的表達與調(diào)控［15］。前期研究發(fā)現(xiàn),ECI1基因?qū)崟r定量PCR和蛋白表達在中國地方豬種(滇南小耳豬、淮豬等)和國外瘦肉型豬(大白、長白)間存在顯著差異(數(shù)據(jù)未發(fā)表)由此提示,ECI1基因極有可能是調(diào)控豬脂肪沉積的重要基因,但關(guān)于豬ECI1基因研究尚未見報道。利用我國地方優(yōu)良品種遺傳資源對當前經(jīng)濟“不利”性狀進行改良具有重要意義,淮豬新品系豬具有產(chǎn)仔數(shù)高、生長快、肉質(zhì)優(yōu)等特點,但與大白豬及長白豬相比存在背膘較厚的缺點［16］。ECI1基因型與淮豬新品系豬背膘厚的相關(guān)性分析表明,ECI1基因intro3-C54T位點對淮豬新品系的背膘厚具有顯著影響,ECI1基因的優(yōu)勢基因為T等位基因,TT為優(yōu)勢基因型,由于淮豬新品系正處于選育中,豬群體內(nèi)部不同基因位點的分離是必然的,卡方檢驗ECI1基因位點在群體中處于哈代溫伯格非平衡狀態(tài)。前期SNP研究結(jié)果顯示,淮豬群體中該位點為C,大白及長白為T,而這也符合淮豬新品系含淮豬血統(tǒng)25%、長白血統(tǒng)25%、大約克血統(tǒng)50%的事實,所以選種時應(yīng)提高T等位基因的頻率,可以選擇TT基因型個體進行留種以降低豬群的背膘厚、加速新品系的選育進程。

［1］Chen Q,Wang H,Zeng Y,et al.Developmental changes and effect on intramuscular fat content of H-FABP and A-FABP mRNA expression in pigs［J］.J Appl Genet,2013,54（1）:119-123.

［2］Aslan O,Hamill R,Davey G,et al.Variation in the IGF2 gene promoter region is associated with intramuscular fat content in porcine skeletal muscle［J］.Mol Biol Report,2012,39（4）:4101-4110.

［3］Fontanesi L,Bertolini F,Scotti E,et al.Polymorphisms in an obesity related gene（PCSK1）are associated with fat deposition and production traits in Italian heavy pigs［J］.Animal,2012,6: 1913-1924.

［4］Han X,Jiang T,Yang H,et al.Investigation of four porcine candidate genes（H-FABP,MYOD1,UCP3 and MASTR）for meat quality traits in Large White pigs［J］.Mol Biol Report,2012, 39（6）:6599-6605.

［5］Chen J N,Jiang Y Z,Cen W M，et al.Distribution of H-FABP and ACSL4 gene polymorphisms and their associations with intramuscular fat content and backfat thickness in different pig populations［J］.Genetics Mol Res,2014,13（3）:6759-6772.

［6］Fontanesi L,Scotti E,Buttazzoni L,et al.A single nucleotide polymorphism in the porcine cathepsin K（CTSK）gene is associated with back fat thickness and production traits in Italian Duroc pigs［J］.Mol Biol Report,2010,37（1）:491-495.

［7］Kilponen J M,Hiltunen J K.β-oxidation of unsaturated fatty acids in humans isoforms of△3-△2-enoyl-CoA isomerase［J］. FEBS Letters,1993,322（3）:299-303.

［8］Hiltunen J K,Qin Y.β-oxidation-strategies for the metabolism of a wide variety of acyl-CoA esters［J］.Biochimica et Biophysica Acta,2000,1484（2-3）:117-128.

［9］Van Weeghel M,te Brinke H,van Lenthe H,et al.Functional redundancy of mitochondrial enoyl-CoA isomerases in the oxidation of unsaturated fatty acids［J］.FASEB J,2012,26（10）: 4316-4326.

［10］李慶崗,陶立,季香,等.MC4R基因在淮豬中的多態(tài)性及其與生長性狀和背膘厚的相關(guān)性［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,（3）:999-1000.

［11］王志秀,李慶崗,楊玉增,等.淮豬新品系豬中FRZB基因與生長性狀相關(guān)位點分析［J］.中國畜牧雜志,2014,50（7）:11-13.

［12］黃培堂.分子克隆實驗指南（第三版）［M］.北京:科學出版社,2002.

［13］李慶崗,許金根,陶立.淮豬新品系Ⅰ系生長性能世代選育進展［J］.畜牧與飼料科學,2009,（6）:100-101.

［14］張沅.家畜育種學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001.

［15］魯云風,石建州,龐振凌,等.△3-△2-烯酰-輔酶A異構(gòu)酶（ECI）對不飽和脂肪酸代謝的作用及其途徑［J］.中國畜牧獸醫(yī),2014,41（8）:123-125.

［16］李慶崗,許金根,陶立.淮豬新品系Ⅰ系胴體及肉質(zhì)性能世代選育進展［J］.養(yǎng)豬,2009,（4）:33-34.

Polymorphisms of ECI1 Gene and Association with Backfat Thickness in New Huai Fattening Pig Line Group

LU Yun-feng1,2,LI Qing-gang3,WANG Zhi-xiu2,ZHANG Bo2,WU Ke-liang2,ZHANG Hao2*
（1.School of Life Science&Technology,Nanyang Normal University,Henan Nanyang 473061,China；2.College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100193,China；3.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Anhui Hefei 230031,China）

The purpose of this research was to analyze genetic relationship betwee n ECI1 gene polymorphisms and backfat thickness of new huai pig line group.Two hundred and eight-six second generation sows ofⅡtype of new huai line of pigs were genotyped at intro3-C54T of ECI1 by using PCR-RFLP.Association analysis was performed to evaluate the correlation of the ECI1 polymorphism with the backfat thickness.In the New Huai fattening Pig Line sow group,the individual number of genotype CC,CT and TT were 48,98 and 140 respectively,and the genotypedistribution was not conform to the expected equilibrium（χ2=15.069,d.f.=1,P＜0.05）due to the population was selected from foundational breeding group.The mean backfat thickness of individuals with genotype CC was higher than those individuals with genotypes TT（P＜0.01）and CT（P＞0.05）.This study convinced the ECI1 have significant effects on the backfat thickness and provided basic data for ECI1 may be used as molecular genetic marker in New Huai line of pigs.

ECI1；backfat thickness；New Huai pig line

S828.2

A

0258-7033（2015）09-0001-03

2014-10-06；

2014-10-28

國家科技支撐計劃（2012BAD3B03）；南陽師范學院高層次人才科研啟動費資助項目（ZX2014071）

魯云風（1980-），男，河南信陽人，博士，講師，主要從事分子生態(tài)方面的研究，E-mail：yunflu@163.com

*通訊作者：張浩，副研究員，主要從事動物遺傳資源與功能基因組研究，E-mail：zhanghao827@163.com