孫雪婷　袁俊杰　蔣玉蓉　陸國(guó)權(quán)　毛前

摘要：為研究藜麥種子總黃酮的最佳提取工藝以及體外抗氧化活性，采用4因素3水平的正交試驗(yàn)法，探討乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提溫度和時(shí)間等因素對(duì)藜麥種子總黃酮的熱回流提取的影響。結(jié)果表明，藜麥種子總黃酮最佳提取條件為：體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，料液比1 g ∶ 30 mL，60 ℃水浴條件下浸提60 min，其黃酮得率為2.64 mg/g。各因素對(duì)總黃酮提取率的影響程度從大到小依次為物料比>浸提時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>浸提溫度?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明，藜麥種子中提取的總黃酮對(duì)DPPH·、·OH的清除率分別達(dá)90.89%、44.90%，其IC50（半抑制濃度）分別為9996、56.639 μg/mL。

關(guān)鍵詞：藜麥；種子；總黃酮；提取工藝；正交試驗(yàn)；抗氧化活性

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0355-04

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）別稱南美藜、奎藜、藜谷、奎奴亞藜等，是一年生的藜科（Chenopodiaceae）草本作物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，至今已有5 000～7 000多年的利用和種植歷史，被印加人稱為“谷物之母”和“安第山的真金”[1-2]。藜麥蛋白質(zhì)含量高達(dá)13%～23%，富含人體無(wú)法生產(chǎn)和必需的9種氨基酸且比例平衡[3-4]；鈣、鐵、鋅、銅、錳、鎂、鉀、硒等礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分的含量均較高[2，5]；藜麥種子中的油脂富含不飽和脂肪酸、類黃酮、B族維生素和維生素E等多種有益化合物。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)為，藜麥?zhǔn)俏ㄒ坏膯我恢仓昙纯蓾M足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物，是最適合人類的全營(yíng)養(yǎng)食品[6]。美國(guó)國(guó)家航空航天局（NASA）更是將藜麥列為人類未來(lái)移民外太空空間的理想的“太空糧食”[7]。

總黃酮是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，是一種生理活性活潑的物質(zhì)，具有抗病毒、抗炎、抗癌防癌、防止動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血脂及膽固醇、抗氧化、防衰老等藥理作用[8]。研究者已用不同方法在甘薯（Ipomoea batatas）[9]、蕎麥（Fagopyrum esculentum）[10]、銀杏（Ginkgo biloba）[11]、枸杞（Lycium chinense Miller）[12]、菊花（Dendranthema morifolium）[13]、柑橘（Citrus reticulata Banco）皮[14]、花生（Arachis hypogaea）殼[15]以及豆科（Leguminosae）植物[16]等中進(jìn)行總黃酮的提取及其含量測(cè)定。然而，有關(guān)藜麥總黃酮含量的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少[17]。本研究挑選已本土化栽培3年、農(nóng)藝性狀較好的藜麥品種Vanilla為材料，采用正交試驗(yàn)法對(duì)藜麥種子總黃酮的乙醇浸提法進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)測(cè)定其抗氧化活性，為優(yōu)質(zhì)高總黃酮得率藜麥品種的選育和利用等相關(guān)領(lǐng)域的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為農(nóng)藝性狀較好的藜麥品種Vanilla，由浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，大田種植于該校官塘農(nóng)場(chǎng)，于2014年4月移載種植，8月下旬收獲種子。種子干燥后充分碾碎，過(guò)60目篩篩選，裝入干燥器皿中備用。

1.2 主要試劑和儀器

試驗(yàn)試劑：DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；蕓香苷對(duì)照購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、硝酸鋁、過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、水楊酸、亞硝酸鈉等試劑（均為國(guó)產(chǎn)分析純）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要儀器：DHG9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）、TP-214電子天平（丹佛儀器有限公司）、XMTD-6000恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）、SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵（河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、752PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藜麥種子總黃酮的提取 參考許鋼等提取黃酮的方法[18-20]，設(shè)計(jì)藜麥黃酮提取的工藝流程：稱取0.5 g干燥粉末→浸提劑浸泡→熱回流提取→冷卻→過(guò)濾→濃縮→定容棕色容量瓶→避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[13] 準(zhǔn)確稱取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)試劑5.000 mg，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇完全溶解后定容至50 mL，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于6支 10.0 mL的試管中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇補(bǔ)至 0.5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min；再加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，再加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇0.4 mL，室溫下放置15 min后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度。取上述中加入溶劑配制的溶液作為空白，于510 nm處比色測(cè)定提取液的吸光度。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）與吸光度（D）關(guān)系曲線的回歸方程：D=0.356 3C-0.009 6；r2=0.999 1。

1.3.3 提取液中總黃酮得率的測(cè)定 分別取“1.2.1”節(jié)所得的待測(cè)總黃酮提取液代替蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟與制作蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)方程相同。計(jì)算公式如下：

總黃酮得率=（C×V1×V2×10-3）/（m/V0）×100%。

其中：C為測(cè)定樣液的質(zhì)量濃度，g/L；V0為測(cè)定吸光度所用樣液的體積，mL；V1為測(cè)定時(shí)的稀釋體積，mL；V2為樣液定容后的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 提取條件的選擇

1.3.4.1 提取溶劑濃度對(duì)總黃酮得率的影響 取濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，料液比為1 g ∶ 30 mL，于60 ℃下熱水浴提取60 min，進(jìn)行總黃酮得率的測(cè)定。endprint

1.3.4.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 在提取溶劑濃度為80%時(shí)，料液比分別取1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL，于60 ℃下熱水浴提取60 min，測(cè)定總黃酮得率。

1.3.4.3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 當(dāng)提取溶劑濃度為80%、料液比為1 g ∶ 30 mL時(shí)，分別在50、60、70、80、90 ℃熱水浴中提取60 min，進(jìn)行總黃酮得率的測(cè)定。

1.3.4.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 在提取溶劑濃度為80%、料液比為1 g ∶ 30 mL的條件下分別提取30、45、60、75、90 min，再于60 ℃熱水浴中提取60 min，測(cè)定總黃酮得率。

1.3.5 正交試驗(yàn)[21] 根據(jù)已有數(shù)據(jù)資料及實(shí)際情況，選擇提取溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，以測(cè)得提取液中的總黃酮得率為考察指標(biāo)，按照正交表L9（34）設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)。

1.3.6 抗氧化性測(cè)定方法

1.3.6.1 DPPH·的清除率[22] 準(zhǔn)確稱取DPPH·標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于無(wú)水乙醇中，超聲5 min，充分振蕩，并定容于 100 mL 容量瓶中，配成0.1 mg/mL DPPH·儲(chǔ)備液，置于冰箱中備用。取不同質(zhì)量濃度的藜麥總黃酮提取液2 mL，分別加入0.1 mg/mL DPPH·溶液2 mL，搖勻，在黑暗中放置30 min，以無(wú)水乙醇為空白在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度D樣品，用無(wú)水乙醇代替DPPH·溶液按上述方法測(cè)定吸光度D對(duì)照，用無(wú)水乙醇代替藜麥種子總黃酮提取液按上述方法測(cè)定吸光度為D空白。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算DPPH·的清除率：DPPH·清除率=[1-（D樣品-D對(duì)照）/D空白]×100%。

1.3.6.2 ·OH的清除率[23-24] 在試管中依次加入濃度為6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，不同質(zhì)量濃度的藜麥種子總黃酮提取液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min，以蒸餾水為空白于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度D樣品，用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測(cè)定吸光度D對(duì)照，用蒸餾水代替總黃酮提取液按上述方法測(cè)定吸光度D空白。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算·OH清除率：·OH清除率=[1-（D樣品-D對(duì)照）/D空白]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 提取溶劑濃度對(duì)總黃酮得率的影響 從圖1可以看出，總黃酮得率隨乙醇濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，于乙醇濃度為80%時(shí)達(dá)到最大。因此，乙醇濃度以70%～90%為宜。

2.1.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 從圖2可以看出，總黃酮得率隨提取劑的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，于料液比為1 g ∶ 30 mL 時(shí)達(dá)到最大。因此，料液比以1 g ∶ 30～50 mL為宜。

2.1.3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 從圖3可以看出，總黃酮得率隨提取溫度的增加呈“增加—降低—增長(zhǎng)”的趨勢(shì)，

于提取溫度為60 ℃時(shí)達(dá)到最大。因此，提取溫度以50～70 ℃ 為宜。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 從圖4可以看出，總黃酮得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低的趨勢(shì)，于提取60 min時(shí)達(dá)到最大。因此，提取時(shí)間以30～60 min為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

將“2.1”節(jié)得到的提取條件結(jié)果按照L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表，L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

由表2可以看出，熱回流法提取藜麥種子總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，即乙醇濃度為80%，料液比為1 g ∶ 30 mL，在60 ℃下提取60 min時(shí)的總黃酮含量最高，可達(dá)2.64 mg/g。試驗(yàn)結(jié)果與Yuko等的研究結(jié)果[25]基本保持一致，具有可靠性。極差值反映的因子影響順序?yàn)锽>D>A>C，即料液比對(duì)提取率的影響最大。

2.3 抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 清除DPPH·效果的測(cè)定 DPPH·（二苯代苦味酰自由基） 在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，深紫色，在 517 nm 處有強(qiáng)吸收。有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子被配對(duì)，而使其顏色變淺，最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度變小，且這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)是成化學(xué)計(jì)量關(guān)系的。因此，用該波長(zhǎng)處的吸光度可檢測(cè)自由基的清除情況，從而評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。抗氧化劑對(duì)DPPH·的清除率越高，其抗氧化性越強(qiáng)。藜麥種子總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用見(jiàn)圖5。

由圖5可知，藜麥種子總黃酮對(duì)DPPH·表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除作用，且與濃度呈正相關(guān)，IC50值為9.996 μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明其清除能力高于小麥麩皮[26]、生姜[27]等。

2.3.2 清除·OH效果的測(cè)定 ·OH是最活潑的自由基，細(xì)胞內(nèi)的H2O2能與Fe2+或Cu2+反應(yīng)生成·OH。另外，紫外線也能使H2O2均裂生成·OH。同時(shí)，·OH也是毒性最大的自由基，它可與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損害，且反應(yīng)速度快[28]。藜麥種子總黃酮對(duì)·OH的清除作用見(jiàn)圖6。

由圖6可知，藜麥種子總黃酮對(duì)·OH表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除作用，且與濃度呈正相關(guān)，其IC50值為56.639 μg/mL，可見(jiàn)其清除能力高于小麥麩皮[26]、小駁骨[29]等。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化藜麥種子總黃酮的提取工藝條件，本著溶劑無(wú)毒性、易回收、對(duì)黃酮溶解力強(qiáng)和工藝簡(jiǎn)單的原則，確定乙醇為最佳提取劑。試驗(yàn)結(jié)果表明最佳工藝條件為：提取溶劑（乙醇）濃度為80%，料液比為1 g ∶ 30 mL，在溫度60 ℃下提取60 min。在此條件下，藜麥種子總黃酮得率高達(dá)2.64 mg/g。藜麥種子總黃酮對(duì)DPPH·和·OH有較好的清除能力，且隨著濃度的增加，清除能力增加，清除率分別可達(dá) 90.89%、44.90%。其 IC50值分別為9.996、56.639 μg/mL。同時(shí)，本工藝在一定程度上節(jié)省原料，從而為其用于工業(yè)生產(chǎn)方面提供了一定的理論依據(jù)。endprint

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