張　玲　(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院兒科，恩施445000)

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過敏性紫癜患兒外周血Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞失衡的研究

張玲(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院兒科，恩施445000)

［摘要］目的:探討Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞失衡在兒童過敏性紫癜(Anaphylactoidpurpura，AP)免疫發(fā)病機(jī)制中的作用。方法:采用流式細(xì)胞儀檢測52例AP患者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的表達(dá)率，采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測外周血中細(xì)胞因子IL-6、TGF-β等的表達(dá)水平。同期30例性別、年齡匹配健康兒童作為對照。結(jié)果:過敏性紫癜急性期患兒外周血中Th17細(xì)胞比例明顯高于正常對照組(P＜0.05)，Th17細(xì)胞調(diào)控因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23水平表達(dá)亦明顯增高(P＜0.05)。Treg細(xì)胞及其調(diào)控因子IL-10和TGF-β1明顯低于對照組(P＜0.05)。結(jié)論:兒童過敏性紫癜患兒外周血Th17、Treg細(xì)胞及其關(guān)鍵調(diào)控因子IL-6、TGF-β等水平的比例失平衡可能與兒童過敏性紫癜的發(fā)病密切相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］兒童;過敏性紫癜; Th17細(xì)胞; Treg細(xì)胞

Research on imbalances of peripheral blood Th17 cells and Treg cells in Anaphylactoid purpura children

ZHANG Ling.Pediatrics of Affiliated Hospital of Hubei National Institute，Enshi 445000，China

［Abstract］Objective: To evaluate the roles of imbalance between peripheral blood T helper17(Th17) cells and CD4+CD25+regulatory T(Treg) cells in the pathogenesis of Anaphylactoid purpura(AP) .Methods: Peripheral blood samples were obtained from fifty-two patients with AP and thirty age-and sex-matched healthy controls.The percentage of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood were detected with Flow cytometry．Furthermore，the serum level of IL-6，IL-17，IL-22 and IL-23 and transforming growth factor (TGF) -β and IL-10 were detected with the use of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) .Results: In comparison with the controls，the AP children showed a higher percentage of Th17 cells and an increased serum level of IL-6，IL-17，IL-22 and IL-23(P＜0.05)，but the percentage of Treg cells and the serum level of TGF-β and IL-10 were significantly lower in AP group(P＜0.05)．Conclusion: AP children experience a change in the percentage of peripheral blood T helper17 cells and CD4+CD25+regulatory T cells in peripheral blood.The imbalance between the Th17 cells and Treg cells in peripheral blood may contribute to the development of Anaphylactoid purpura.

［Key words］Children; Anaphylactoid purpura; T helper17 cells; Regulatory T cells

過敏性紫癜(Anaphylactoid purpura，AP)是一種兒童時期多發(fā)的、主要波及小血管的自身免疫性血管炎性疾病，常見臨床表現(xiàn)包括紫癜、消化道癥狀、關(guān)節(jié)痛和腎損害。目前普遍認(rèn)為AP患兒體內(nèi)免疫功能失衡與其病理、臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，在其發(fā)病中起著重要的作用［1，2］。

近年發(fā)現(xiàn)Th17和Treg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)對維持正常免疫應(yīng)答及防止自身免疫性疾病的發(fā)生相關(guān)，但該平衡的狀態(tài)與AP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不清楚［3-6］。本研究旨在分析AP患兒外周血內(nèi)Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比率及相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、TGF-β1等的變化，為進(jìn)一步探討兒童過敏性紫癜的免疫學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2012年1月至2013年12月在我院兒科就診的AP急性發(fā)作期患兒52例，其中，男30例，女22例;年齡2～14歲，平均(7.28± 4.0)歲;所有患兒均符合過敏性紫癜的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患兒均為初次發(fā)病，既往均未使用任何糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒性藥物。正常對照組選擇我院健康體檢中心體檢正常兒童，包括男16例，女14例，年齡4～14歲，平均年齡(7.61±3.8)歲，所有對照組入選兒童均排除家族過敏史及自身免疫病史。兩組患兒在性別、年齡、骨折部位等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究所有受試對象均知情同意并經(jīng)院倫理委員會討論批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)方法所有受試者在入院后

24 h內(nèi)空腹無菌采集外周靜脈血約6 ml，置于抗凝管中，分別分成兩管，每管約3 ml。其中一管運(yùn)用密度梯度離心法分離單一核細(xì)胞(PBMC)，待流式細(xì)胞儀檢測;另一管離心后(3 500 r/min，5 min)留取血清，于－20℃存放備用待檢測。采用購自Becton Dickimn公司的FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測外周血Th17與Treg細(xì)胞［7］。取上述凍存血清，采用ELISA抗體夾心法檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-22、IL-23和IL-10、TGF-β1［8］。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，分別以RORγt mRNA、Foxp3 mRNA特異性引物在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈連鎖反應(yīng)(RT-PCR)。后用瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)掃描以檢測基因，并與內(nèi)參照的條帶灰度值的比值讀取該基因mRNA的表達(dá)水平

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0(SPSS Inc，Chicago，IL)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料統(tǒng)計值以x ±s表示。兩組獨(dú)立樣本比較，對正態(tài)分布計量資料采用t檢驗(yàn)，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)用于非正態(tài)分布計量資料的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　兒童過敏性紫癜組與對照組Th17、Treg表達(dá)率比較(x±s，%)Tab．1 Comparison of expression rate of Th17/Treg cellbetween AP group and control group(x±s，%)

表2　兒童過敏性紫癜組與對照組轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)率比較(x ±s)Tab．2 Comparison of expression of transcription factors between AP group and control group(x ±s)

表3　兒童過敏性紫癜組與對照組Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子比較(x ±s，ng/L)Tab．3 Comparison of serum level of Th17-related cytokines between AP group and control group(x ±s，ng/L)

2　結(jié)果

2.1兒童過敏性紫癜組與對照組Th17、Treg表達(dá)率比較本研究通過對52例AP患兒和30例正常對照者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)AP組外周血中Th17細(xì)胞比例為(1.20±0.41) %，高于對照組(0.54±0.28) %，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) ;同時，急性期AP患兒外周血Treg細(xì)胞比例為(2.29±0.67) %，低于對照組(5.95±0.45) %，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，表1)。

2.2兒童過敏性紫癜組與對照組轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)率比較RORγt和Foxp3分別是Th17和Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。如表2所示，急性期AP患兒RORγt的表達(dá)明顯高于正常對照組(P＜0.0001)，而Foxp3的表達(dá)率明顯低于對照組(P＜0.0001)。

2.3兒童過敏性紫癜組與對照組Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子比較IL-6、IL-17、IL-22和IL-23 是Th17細(xì)胞的相關(guān)細(xì)胞因子，急性期AP患兒以上細(xì)胞因子的表達(dá)均高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (表3)，而AP急性期患兒Treg細(xì)胞細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1表達(dá)明顯低于對照組(P＜0.05) (表4)。

表4　兒童過敏性紫癜組與對照組Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子比較(x ±s，ng/L)Tab．4 Comparison of serum level of Treg cell-related cytokines between AP group and control group (x ±s，ng/L)

3　討論

過敏性紫癜(AP)是兒童期常見的自身免疫性血管炎性疾病，感染是目前已知誘發(fā)AP發(fā)病的重要原因，但具體免疫發(fā)病機(jī)制尚未闡明。近年研究顯示AP急性期患兒體內(nèi)存在體液免疫紊亂、T細(xì)胞亞群功能失調(diào)及細(xì)胞因子分泌異常等多種免疫功能失衡，且與其病理、臨床表現(xiàn)密切相關(guān)［1，2，6，8-10］。

Th17和Treg是CD4+T細(xì)胞的兩種功能不同的細(xì)胞亞型［3，5］。Th17細(xì)胞分泌的IL-17等炎癥細(xì)胞因子可誘導(dǎo)體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生多種前炎癥細(xì)胞因子及趨化因子，介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。既往發(fā)現(xiàn)哮喘、強(qiáng)直性脊柱炎、炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞比例均有增加。Treg細(xì)胞是一類具有抑制自身免疫功能的T細(xì)胞亞群，正常情況下外周血中一定數(shù)量的Treg細(xì)胞能抑制Th17細(xì)胞的增生及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生，起到免疫調(diào)節(jié)的作用。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的平衡是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的重要因素［6］。目前Th17/Treg的平衡在許多免疫性疾病和感染性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用得到廣泛的研究。

既往研究發(fā)現(xiàn)在過敏性紫癜患兒外周血中，急性期調(diào)節(jié)性CD4+CD25+T細(xì)胞亞群Treg細(xì)胞比例明顯降低，其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)亦明顯降低。與此同時，CD4+T細(xì)胞IL-17A及IL-17F表達(dá)增高。Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt等前炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)亦明顯增高［7，8，11-14］。由此表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的減少并由此引起免疫抑制效應(yīng)不足可能是過敏性紫癜急性期免疫失衡的重要原因。我們的研究顯示過敏性紫癜患兒外周血Th17細(xì)胞的比率為(1.20± 0.41) %，AP患者組血清Th17的含量明顯高于對照組。同時，急性期AP患兒外周血中Treg細(xì)胞比例為(2.29±0.67) %，低于對照組(5.95±0.45) %，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和白細(xì)胞介素6(IL-6)是兩種誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，TGF-β通過在外周誘導(dǎo)Foxp3蛋白的表達(dá)，從而維持Treg細(xì)胞的數(shù)量、功能［8，11］。但是，當(dāng)體內(nèi)存在有較高濃度的IL-6時，其可在抑制TGF-β誘導(dǎo)表達(dá)Foxp3同時，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt的表達(dá)，使初始CD4+T細(xì)胞分化為Th17亞細(xì)胞群。通過對52 例AP患兒和30例正常對照者血清Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，AP患兒組血清IL-6、IL-17、IL-22和IL-23的含量明顯高于對照組; AP患兒組血清IL-10和TGF-β1的含量明顯低于對照組(P＜0.01)。關(guān)鍵調(diào)控因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23在急性期AP患者外周血中高表達(dá)，IL-10和TGF-β1的表達(dá)降低說明過敏性紫癜急性期患兒Th17細(xì)胞過度活化及Treg細(xì)胞表達(dá)不足可能與感染因素誘導(dǎo)的IL-6高表達(dá)及Th17/Treg失平衡有關(guān)。

綜上所述，過敏性紫癜患兒外周血中Th17細(xì)胞及其調(diào)控因子IL-6水平增高，Treg細(xì)胞及其調(diào)控因子TGF-β降低，從細(xì)胞和細(xì)胞調(diào)控因子水平表明急性期過敏性紫癜患兒體內(nèi)存在Th17/Treg失平衡，其具體機(jī)制及能否通過臨床調(diào)節(jié)IL-6等關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)更好地控制AP的免疫炎性反應(yīng)，尚需進(jìn)一步探討。

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［收稿2015-01-20修回2015-02-04］

(編輯倪鵬)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．024

作者簡介:張玲(1965年－)，女，副主任醫(yī)師，主要從事行為發(fā)育、臨床醫(yī)療感染等方面研究，E-mail: zhangling _ hb @ 126.com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1404-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號R725