林曉斌 徐燕510000廣東省廣州市番禺中心醫(yī)院

Mbd2基因在子宮內膜異位癥中的表達

林曉斌 徐燕
510000廣東省廣州市番禺中心醫(yī)院

目的：探討Mbd2在EM s患者發(fā)病過程中的可能作用。方法：Trizol法提取病變組織的總RNA，反轉錄生成cDNA，Blast-primer設計Mbd2mRNA引物，Real-time PCR方法檢測各組間Mbd2mRNA表達變化。結果：EM s患者異位內膜、在位內膜中Mbd2mRNA表達顯著高于子宮肌瘤患者在位內膜（P＜0.01）；且EM s患者異位內膜中Mbd2 mRNA的表達顯著高于在位內膜（P＜0.01）。結論：Mbd2基因參與子宮內膜異位癥的發(fā)生，還可能為子宮內膜異位癥的早期發(fā)現(xiàn)做出貢獻。

Mbd2；子宮內膜異位癥；Real-time PCR

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMs）是一種較為常見的婦科疾病，患者常表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛或性交痛，還可能合并不孕。其病因以及發(fā)病機制尚不清楚，內分泌、免疫、遺傳以及環(huán)境因素都可能與其有關。近年來，表觀遺傳學，尤其是DNA甲基化在EMs的發(fā)病機制中得到了廣泛關注[1]。

資料與方法

2014年3月-2015年4月收治因子宮肌瘤、卵巢巧克力囊腫行手術治療的子宮肌瘤患者30例，平均年齡（28.7±7.9）歲；EMs患者30例，平均年齡（29.2±8.6）歲。所有患者月經(jīng)規(guī)律，無宮內節(jié)育器，手術前0.5年內未曾服用抗炎或激素類藥物。所有組織均經(jīng)病理驗證。標本采集均得到患者本人或家屬知情授權，符合倫理標準。

主要試劑：Trizol、異丙醇、氯仿、75％乙醇、M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、oligo dT、PCR引物、ABIPCRMix液。

主要儀器：ABI 7500 PCR儀、漩渦混合器、迷你離心機、低溫高速離心機、普通PCR儀、核酸定量儀。

試驗方法：總RNA提取及檢測：嚴格按照Trizol說明書進行操作，瓊脂糖電泳鑒定RNA的完整性，核酸定量儀檢測總RNAOD值，換算成微克。

反轉錄反應：①反轉錄體系：2μ g總RNA，100 pmol oligo dT，5μL反轉錄buffer，0.625μL RNA酶抑制劑，1μLM-MLV酶，最后，DEPC水補充至25μL。②反轉錄條件：42℃ 60 min，95℃5min，4℃保存。

Real-time PCR：①引物序列：Gapdh：F：GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT，R：GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA；Mbd2：F：ACGAATGAATGAACAGCCACG， R： TGCTACCTGGACCAACTCCT。②反應體系：12.5μL Abi PCRmix液，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，1.0μL cDNA，加水補足至25 μL。③反應條件：階段1：50℃下2min；階段2：95℃10 min；階段3：95℃15 s，60℃60 s；階段4：收集溶解曲線條件95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。階段3 和4循環(huán)40次。

統(tǒng)計學處理：本研究中采用SPSS 17.0軟件對計量數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（±s）表示，采用one-way ANOVA進行各組間數(shù)據(jù)比較，P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。

結果

各組間Mbd2 mRNA的相對表達變化，見表1。

組間Mbd2mRNA的相對表達變化，見圖1。

討論

人類腫瘤細胞中DNA甲基化的改變可以視為腫瘤生物標志之一[2]，而EMs與腫瘤具有非常類似的特性，比如細胞增殖、侵襲性及遷移等。目前學術界研究發(fā)現(xiàn)EMs可能是一種表觀遺傳學疾病[3]。

Mbd2（methyl-CpG-binding domain 2，Mbd2）是具有甲基CpG結合結構域的蛋白家族成員之一，可與組蛋白去乙?；感纬蓮秃象w，抑制基因表達。目前認為Mbd蛋白可以招募組蛋白去乙?；傅交蚪M上的甲基CpG富集區(qū)，從而抑制轉錄。另有報道顯示，Mbd2可以特異性地結合甲基化的DNA，可以從甲基化的基因啟動子區(qū)抑制轉錄的發(fā)生[4]。然而，有研究報道Mbd2可以起到去甲基化的作用，從而活化基因轉錄[5]，而DNA甲基化通常引起基因轉錄抑制。

表1 各組間Mbd2mRNA的相對表達變化（±s）

表1 各組間Mbd2mRNA的相對表達變化（±s）

注：與肌瘤在位內膜比較，??P＜0.01；與EM s在位內膜，##P＜0.01。

組別組 M bd2mRNA肌瘤在位內膜 0.31±0.04 EM s在位內膜 0.54±0.11??EM s異位內膜 1.12±0.35??##

本次試驗中，我們利用Real-Time PCR檢測了子宮肌瘤在位內膜、EMs在位內膜以及EMs異位內膜組織中Mbd2 mRNA的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)EMs患者異位內膜、在位內膜中Mbd2mRNA表達顯著高于子宮肌瘤患者在位內膜（P＜0.01）；且EMs患者異位內膜中Mbd2mRNA的表達顯著高于在位內膜（P＜0.01）。根據(jù)我們自己的試驗結果以及他人研究發(fā)現(xiàn)，我們推測，在EMS發(fā)生過程中，Mbd2mRNA的表達上調抑制了某些具有類似于抑癌基因作用的基因的表達，使得子宮內膜獲得了增殖、遷移以及定植的能力，從而發(fā)生了EMS或者加重了這一疾病過程。

圖1 各組間Mbd2 mRNA的相對表達變化

[1] 吳夏迪,曲娟,崔毓桂,等.表觀遺傳學和環(huán)境因素與子宮內膜異位癥[J].國際生殖健康/計劃生育雜志,2015,34（1）：75-79.

[2] Wu Y,Strawn E,Basir Z,et al.Aberrant expression of deoxyribonucleic acid methyltransferases DNMT1,DNMT3A,and DNMT3B in women with endometriosis[J].Fertil Steril,2007,b（87）：24-32.

[3] 胡月陽,王芳,王俊霞.子宮內膜異位癥相關的表觀遺傳學研究進展[J].發(fā)育醫(yī)學電子雜志,2014,2（4）：248-252.

[4] Zhu D,Hunter SB,Vertino PM,et al.Overexpression of MBD2 in glioblastomamaintains epigenetic silencing and inhibits the antiangiogenic function of the tumor suppressor gene BAI1[J].Cancer Res,2011,71：5859-5870.

[5] Fuso A,Nicolia V,Cavallaro RA,et al.DNA methylase and demethylase activities are modulated by one-carbonmetabolismin Alzheimer's diseasemodels[J].JNutr Biochem, 2011,22：242-251.

Expression of Mbd2 gene in patientsw ith endom etriosis uterina

Lin Xiaobin,Xu Yan
Panyu CentralHospitalofGuangzhou City,Guangdong Province 510000

Objective：To investigate the possible effectofMbd2 in the pathogenesis of EMs.Methods：General RNA was extracted from diseased tissues by Trizolmethod,then generated cDNA through reverse transcription.Mbd2mRNA primerwas designed by Blast-primer,and detected the expression of mRNA Mbd2 using Real-time PCR.Results：The expression of Mbd2 mRNA in ectopic endometrium and position intima of patients with EMs were significantly higher than those of patients with hysteromyoma（P＜0.01）；in patientswith Ems,the expression ofMbd2mRNA in ectopic endometrium was significantly higher than in position intima（P＜0.01）.Conclusion：Mbd2 gene involved in the occurrence ofendometriosisuterina andmay contribute to the early detection ofendometriosisuterina.

Mbd2；Endometriosisuterina；Real-time PCR

表1 兩組的Killip分級、LVEF等指標對比（±s）

表1 兩組的Killip分級、LVEF等指標對比（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05。

組別 例數(shù) cTnT（mg/m L） CK-MB（U/L） LVEF（％） Killip分級[例（％）]Ⅰ級 Ⅱ級 Ⅱ級以上對照組 31 3.78±2.90 146.70±89.05 60.72±6.83 16（51.61） 13（41.94） 2（6.45）研究組 29 6.31±3.82＊ 197.51±97.10＊ 46.80±9.15＊ 12（41.38） 10（34.48） 7（24.18）＊

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.26.69