辛?xí)詵|，李偉，胡芳，趙清華，王明泉，孫韶華，賈瑞寶

(山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測中心，濟(jì)南 250021)

硒是生物體內(nèi)必需的生物微量元素，具有重要的生理生物活性。人體內(nèi)硒水平下降將直接影響骨骼、心肌及肝、眼、前列腺、甲狀腺等重要的生命器官。據(jù)報道，膳食中以富硒酵母形式補充硒的攝入，可使癌癥發(fā)病率、死亡率下降50%左右。我國科學(xué)家通過補硒預(yù)防治療克山病，大骨節(jié)病，肝癌等威脅人類健康的重大疾病，在國際上已獲重大進(jìn)展。然而，硒是一種典型的雙功能元素，適量的硒有利于人體健康，但過量攝入硒又可能導(dǎo)致中毒，當(dāng)日均攝入量為750～950 μg 時［1］，會引起硒中毒。人、馬及牛一次服用硒的最小致死劑量分別為2～4，1.5，4.5～5.0 mg／kg［2］。因 此，GB 2006–5749 《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了飲用水中硒的限值為0.01 mg／L。

硒在自然界中的存在形態(tài)分為無機(jī)硒和有機(jī)硒。無機(jī)硒主要有單質(zhì)硒、硒化物、亞硒酸鹽、硒酸鹽等；有機(jī)硒主要有硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒乙硫基氨基酪酸、硒甲基硒代半胱氨酸、硒甲基硒代蛋氨酸、硒脲、硒胱胺、二甲基硒、二甲基二硒、三甲基硒、二乙基硒、甲基亞硒酸脂、甲基硒砜、硒蛋白等。硒的毒性和生物利用度在很大程度上取決于硒的化學(xué)形態(tài)，如亞硒酸鹽的毒性略大于硒酸鹽，無機(jī)硒的毒性大于以氨基酸和蛋白質(zhì)結(jié)合的有機(jī)硒，硒代氨基酸、植物中的硒化合物以及水溶性硒酸鈉和亞硒酸鈉的生物利用度較高［3］。因此對水中不同價態(tài)硒的檢測評價具有重要意義。

目前不同形態(tài)硒的檢測方法主要采用高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜(GC)或毛細(xì)管電泳法將不同形態(tài)硒分離后再連接到電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP–MS)、原子熒光儀(AFS)、質(zhì)譜儀(MS)等檢測器進(jìn)行分析［4–11］。GC–MS、LC–MS在檢測時需進(jìn)行衍生，操作繁瑣；HPLC–ICP–MS法作為一種高靈敏的分析測試技術(shù)在金屬及類金屬形態(tài)分析領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［12–16］。

由于水中硒含量較低，現(xiàn)有方法不能滿足水中硒形態(tài)分析的要求，因此筆者利用高效液相色譜法，通過優(yōu)化色譜流動相成分與比例，分離水中兩種常見的痕量硒形態(tài)(硒酸根、亞硒酸根)，結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜系統(tǒng)，建立了水中硒形態(tài)的分析方法。該方法實現(xiàn)了對水中常見不同形態(tài)硒的同時分析，具有選擇性好、檢測范圍寬、檢測速度快等特點，在水質(zhì)分析領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：NexIon 300x型，美國Perkin Elmer公司；

高效液相色譜分離系統(tǒng)：Flexar型，美國Perkin Elmer公司；

超純水機(jī)：Mill-iQ型，美國Millipore公司；

四丁基氫氧化銨(TBAOH)：1 mol／L；

乙酸銨、乙二胺四乙酸二鉀［EDTA(鉀)］：分析純；

甲醇：色譜純；

硒酸根貯備液(以Se計)：0.525 μmol／g，中國計量科學(xué)研究院；

亞硒酸根貯備液(以Se計)：0.543 μmol／g，中國計量科學(xué)研究院；

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

(1)液相色譜條件。色譜柱：C8色譜柱(3 μm×3 cm，美 國Perkin Elmer公 司)；流動 相：0.15 mmol／L EDTA(鉀)–0.1 mmol／L TBAOH–0.15 mmol／L乙 酸 銨–5%甲 醇(用HNO3，NH4OH調(diào)節(jié)流動相pH為6～7)，流量為1.5 mL／min；進(jìn)樣體積：50 μL。

(2)ICP–MS條件。采用標(biāo)準(zhǔn)模式Rpq 0.25；積 分 時 間：250 ms；分 析 時 間：5 min；Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)保留時間分別為0.3，1.4 min。

1.3 樣品前處理

水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后可直接進(jìn)行分析，濃度較大的水樣用流動相稀釋后進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1 離子對試劑及其濃度

由于待分析的硒以含氧酸根陰離子形式存在，會與加入的離子對試劑形成非極性離子對，在C8色譜柱中有不同程度的吸附而無法實現(xiàn)分離，故采用四丁基銨鹽(Bu4N+)作為離子對試劑。與Bu4N+離子結(jié)合的陰離子會影響不同形態(tài)硒的保留時間，比較使用溴離子、硫酸根、氫氧根的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用氫氧根的四丁基銨鹽有較好的分離效果，因此選用四丁基氫氧化銨(TBAOH)作為離子對試劑。

增加TBAOH的濃度會增加TBAOH和離子對競爭而吸附在固定相的機(jī)會，使離子對吸附在固定相的比率減少，保留時間縮短；同時也會增加硒和TBA+結(jié)合成離子對的機(jī)會，增加保留時間，此兩者為競爭性反應(yīng)。配制TBAOH濃度分別為0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol／L的流動相，對比兩種價態(tài)硒的保留時間，見圖1。由圖1可知，流動相中TBAOH的濃度小于0.1 mmol／L時，Se(Ⅳ)，和Se(VI)的保留時間間隔小，不易分開；TBAOH濃度大于0.1 mmol／L時，Se(Ⅳ)，和Se(Ⅵ)的保留時間間隔增大。因此選擇TBAOH濃度為0.1 mmol／L。

圖1 流動相中TBAOH對Se(IV),Se(VI)保留時間的影響

2.1.2 甲醇含量

增加流動相中甲醇含量可以降低流動相的極性，使離子對在管柱內(nèi)的保留時間縮短，但過量的甲醇會使電流不穩(wěn)定。改變流動相中甲醇的含量，考察SeSe(Ⅳ)，Se(Ⅵ)的分離情況，見圖2。由圖2可知，隨著流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，SeSe(Ⅳ)，Se(Ⅵ)的保留時間縮短；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)大于5%時，Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)保留時間繼續(xù)縮短，導(dǎo)致無法分離，此外甲醇體積分?jǐn)?shù)過高會導(dǎo)致儀器點火失敗。因此選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)為5%。

圖2 流動相中甲醇含量對Se(IV),Se(VI)保留時間的影響

2.1.3 EDTA(鉀)濃度對分離的影響

在流動相中添加EDTA(鉀)能增加流動相的離子強度，并增強與固定相的作用力，使硒的保留時間縮短，而過多的EDTA(鉀)又會使砷的分離程度變差。為了能在最短時間內(nèi)將兩種形態(tài)的硒有效分離，EDTA(鉀)濃度選擇為0.15 mmol／L。

2.1.4 pH值對分離的影響

流動相pH值的改變對不同形態(tài)硒的保留時間、出峰效果影響很大。當(dāng)pH值為6～7時，兩種形態(tài)硒的色譜峰形較好，分離良好，無拖尾現(xiàn)象；當(dāng)pH值為5～6時，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；當(dāng)pH<5或pH>7時，無法形成良好的峰型。因此確定流動相的pH值為6～7。

2.2 工作曲線方程與檢出限

用流動相稀釋配制一系列不同濃度Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(2，5，10，20，50，100 μg／L)，進(jìn)樣測定。以目標(biāo)化合物的的色譜峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得工作曲線方程，Se(Ⅳ)：Y=3683.3X–128.42；Se(Ⅵ)：Y=4 072.1X–3 176，相關(guān)系數(shù)r2均不低于0.999，線性范圍為2～100 μg／L。

以3倍信噪比計算儀器的檢出限(LOD)，以10倍信噪比計算儀器的定量限(LOQ)，結(jié)合樣品前處理的稀釋倍數(shù)計算得到Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)的檢出限分別為0.05，0.03 μg/L，定量限均為2，2 μg/L。

圖3為Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)混合溶液(2 μg／L)色譜圖。由圖3可知，Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)均實現(xiàn)了基線分離，互不干擾。

圖3 Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)混合溶液色譜圖色譜圖

2.3 回收率及精密度試驗

以水源水、供水廠出廠水(除氯后)、管網(wǎng)水(除氯后)為基體進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表1。由表1可知，Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)的回收率分別為102.3%～106.2%，104.7%～108.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.4%～9.6%，4.4%～7.3%。說明該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。該法適用于水源水中無機(jī)硒的形態(tài)分析。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果(n=5)

2.4 實際水樣測定

實際樣品的采集應(yīng)選擇使用塑料材質(zhì)的采樣器皿，運輸過程中應(yīng)避光。采集后應(yīng)立刻測定，如無法立刻測定，則需將水樣置于4℃冰箱中避光保存。

將建立的方法應(yīng)用于濟(jì)南市4座水庫水樣的測定，結(jié)果見表2。由表2可知，各水庫中的硒含量滿足GB 3838–2002 《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中二類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求，4座水庫中的硒主要以硒酸根的形式存在。

表2 實際水樣測定結(jié)果 μg／L

3 結(jié)語

采用HPLC–ICP–MS法實現(xiàn)了對水中硒酸根、亞硒酸根的分離與測定。Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)可在4 min內(nèi)有效分離。該方法靈敏度高，具有良好精密度和準(zhǔn)確度，在環(huán)境水體元素形態(tài)分析中有良好的應(yīng)用前景。

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