李 琴，賀艷艷，張瑜斌

（廣東海洋大學(xué)海洋資源與環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，廣東湛江524088）

東海島北寮高位蝦池養(yǎng)殖過(guò)程細(xì)菌數(shù)量變化及其對(duì)抗生素的耐藥性

李 琴，賀艷艷，張瑜斌

（廣東海洋大學(xué)海洋資源與環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，廣東湛江524088）

采用平板計(jì)數(shù)法研究了湛江東海島北寮村3個(gè)高位蝦池養(yǎng)殖過(guò)程水體和沉積物的可培養(yǎng)細(xì)菌與弧菌（Vibrio）的數(shù)量變化，并利用紙片擴(kuò)散法測(cè)定了分離自蝦場(chǎng)環(huán)境細(xì)菌對(duì)12種抗生素的耐藥性．結(jié)果表明，調(diào)查的養(yǎng)殖過(guò)程中，2個(gè)蝦池水體細(xì)菌與弧菌數(shù)量變化呈單峰趨勢(shì)，9月份達(dá)到峰值；蝦池沉積物以及水源地中細(xì)菌與弧菌數(shù)量變化無(wú)明顯的規(guī)律．BL1樣池沉積物細(xì)菌和弧菌數(shù)均與氨氮呈顯著正相關(guān)（p＜0．05），水中的弧菌數(shù)與硝酸鹽氮呈顯著正相關(guān)（p＜0．05）；蝦池細(xì)菌、弧菌數(shù)與多數(shù)調(diào)查的生態(tài)因子之間相關(guān)性不顯著（p＞0．05）．蝦場(chǎng)環(huán)境細(xì)菌的抗生素耐藥性測(cè)定結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)12種抗生素的耐藥性差異顯著（p＜0．05），細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素耐藥性最高，在對(duì)照水源地沉積物中高達(dá)80．65%，其次為先鋒Ⅴ和甲氧芐胺嘧啶，而對(duì)左氟沙星、環(huán)丙沙星、多黏菌素B均敏感；樣地水體和沉積物細(xì)菌對(duì)抗生素表現(xiàn)出相似的耐藥性譜，兩者的細(xì)菌耐藥性呈顯著正相關(guān)（p＜0．05）；養(yǎng)殖蝦池與對(duì)照水源地的細(xì)菌耐藥性差異不顯著（p＞0．05）；對(duì)照水源地BL4沉積物中細(xì)菌耐藥性顯著高于水體（p＜0．05）；3個(gè)樣地細(xì)菌對(duì)抗生素均表現(xiàn)出較高的多重耐藥性（MAR）．

蝦池；細(xì)菌；豐度；抗生素；耐藥性

細(xì)菌在蝦池的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中有著重要的作用，一方面有益細(xì)菌分解有機(jī)質(zhì)降低蝦池有機(jī)物負(fù)荷，同時(shí)為浮游植物提供大量的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)；另一方面病源性細(xì)菌會(huì)引起對(duì)蝦病害發(fā)生．當(dāng)前，抗菌藥物的使用是預(yù)防和治療蝦場(chǎng)細(xì)菌病害的主要途徑之一［1］，但抗生素的長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致環(huán)境菌群耐藥性的增強(qiáng)［2］，反過(guò)來(lái)又增加了病害的防治難度．對(duì)蝦高位池養(yǎng)殖是一種高效益和高風(fēng)險(xiǎn)并存的養(yǎng)殖模式［3］，為保證該模式的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，一些學(xué)者研究了高位蝦池養(yǎng)殖過(guò)程細(xì)菌種群數(shù)量的變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系［4－5］，細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)［6］和功能特征［7］，為其高效運(yùn)轉(zhuǎn)提供了相關(guān)的理論基礎(chǔ)．盡管環(huán)境中抗生素耐性基因可通過(guò)水平擴(kuò)散傳遞給病原細(xì)菌，由此增加抗生素防治養(yǎng)殖過(guò)程細(xì)菌疾病的難度已愈來(lái)愈為多數(shù)研究者認(rèn)同［8］，但迄今有關(guān)蝦池細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性研究多見于養(yǎng)殖病原細(xì)菌［9－11］，對(duì)蝦養(yǎng)殖水域和沉積物環(huán)境細(xì)菌（包括弧菌和氣單胞菌）耐藥性在國(guó)外已有學(xué)者開展了研究［12－14］，而國(guó)內(nèi)在此方面的研究鮮有報(bào)道．本實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)典的微生物學(xué)方法，研究了湛江東海島北寮村3個(gè)高位蝦池和水源地從放苗到收蝦的養(yǎng)殖過(guò)程水體和沉積物中的細(xì)菌數(shù)量變化及其環(huán)境細(xì)菌對(duì)常見抗生素的耐藥性，結(jié)合主要生態(tài)因子的調(diào)查，以期為對(duì)蝦高位池養(yǎng)殖生產(chǎn)管理及合理使用抗菌藥物防治蝦池細(xì)菌病害提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 研究蝦場(chǎng)概況

本研究的蝦場(chǎng)位于湛江東海島北寮村（20° 56．923′N，110°31．527′E）（圖1）．在該村的養(yǎng)殖蝦場(chǎng)中選取3個(gè)高位蝦池作為研究樣池，分別標(biāo)記為BL1、BL2、BL3，其中BL3為養(yǎng)殖過(guò)程發(fā)病蝦池，3個(gè)樣池池齡均為5年，池深1．6 m左右，養(yǎng)殖的對(duì)蝦均為南美白對(duì)蝦又名凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）．其中BL1和BL2樣池用于調(diào)查細(xì)菌和弧菌數(shù)量及其相關(guān)生態(tài)因子變化，而BL1和BL3樣池用于環(huán)境細(xì)菌的抗生素耐藥性研究．放苗前蝦池均按高位蝦池養(yǎng)殖要求作消毒、清洗處理［3］，養(yǎng)殖期間根據(jù)蝦池養(yǎng)殖情況適量添加排毒養(yǎng)水寶和漂白粉（含氯≥30%）等藥物進(jìn)行池體消毒．其中BL4為對(duì)照研究的蝦場(chǎng)水源地（20°56．968′N；110°31．739′E），距離養(yǎng)殖樣池大約100 m，即為沙質(zhì)海灘，也是蝦池廢水的排放地．

1．2 樣品的采集

根據(jù)《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》采集水樣和沉積物樣品［15］．水樣用HQM-1簡(jiǎn)易采水器多點(diǎn)采集蝦池和水源地表層0．5 m處的水樣，分別混勻后裝入棕色磨口無(wú)菌玻璃瓶貯存；沉積物樣用小鏟刮擦收集蝦池表層1～2 cm處的樣品混勻后放入無(wú)菌玻璃瓶中貯存，采樣器具均作無(wú)菌處理．采集好的樣品裝入放有冰塊的泡沫冷藏箱中，立即送回實(shí)驗(yàn)室分析．從放苗到收蝦共5次采樣，采樣日期依次為2012年8月8日、8月22日、9月3日、9月16日和9月29日．

圖1 湛江東海島北寮村的蝦場(chǎng)位置Fig．1 Location of shrimp farming at Beiliao village on Donghai island of Zhanjiang

1．3 樣品的分析

（1）細(xì)菌和弧菌數(shù)量的分析 細(xì)菌和弧菌數(shù)量的測(cè)定用10倍稀釋涂布平板法［16］，每個(gè)樣品分別選取合適的梯度涂布平板，每個(gè)梯度重復(fù)3個(gè)平板．細(xì)菌采用2216E培養(yǎng)基［16］，弧菌采用TCBS培養(yǎng)基［16］（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），保持培養(yǎng)基的鹽度近似于蝦池水體鹽度．接種后的平板28℃恒溫培養(yǎng)，36 h后計(jì)數(shù)［16］．另外稱取20 g左右的沉積物樣品105℃烘干，計(jì)算含水量和水分系數(shù)．細(xì)菌和弧菌數(shù)量最終結(jié)果沉積物以每克干質(zhì)量的菌落數(shù)表示（cfu／g· dw），而水樣則以每毫升的菌落數(shù)（cfu／mL）表示．

（2）細(xì)菌的藥敏性分析 從2216E平板中挑取不同形態(tài)和顏色的單個(gè)細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)入2216E斜面培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)［16］，將純化后的單菌株冷藏保存，以備藥敏實(shí)驗(yàn)使用．

本項(xiàng)研究使用的細(xì)菌藥敏試驗(yàn)方法為美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的紙片擴(kuò)散法（K-B法）［14］，所選用的12種藥敏紙片直徑均為6 mm，各種紙片的名稱與藥物含量如下：氨芐青霉素10 μg／片、慶大霉素10 μg／片、紅霉素15 μg／片、甲氧芐胺嘧啶（TMP）5 μg／片、左氟沙星5 μg／片、四環(huán)素30 μg／片、氯霉素30 μg／片、環(huán)丙沙星5 μg／片、復(fù)方新諾明1．25／23．75 μg／片，甲氧芐胺嘧啶5 μg／片（復(fù)方新諾明為兩種物質(zhì)的復(fù)合物）、頭孢唑啉（先鋒V）30 μg／片、多黏菌素B 30 μg／片、萘啶酸30 μg／片，均在有效期內(nèi)使用［17］．以大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行質(zhì)量控制．根據(jù)NCCLS的藥敏實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)分析細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，判定并記錄菌株對(duì)抗生素的耐藥狀況，即敏感（S）、中介（I）或耐藥（R），細(xì)菌的耐藥性標(biāo)記為耐藥菌株占所測(cè)試菌株的百分率．其中，多重耐藥性（multiple antibiotic resistance，MAR）［18］界定為測(cè)試的菌株對(duì)3種或者3種以上的抗生素同時(shí)具有耐藥性，n重耐藥性表示為MAR（n）（n為自然數(shù)且n≥3）．藥敏實(shí)驗(yàn)共隨機(jī)測(cè)試了224株細(xì)菌菌株，其中31株分離自BL1水樣，37株分離自BL1沉積物樣，38株分離自BL3水樣，31株分離自BL3沉積物樣，33株分離自對(duì)照的BL4水樣，54株分離自BL4沉積物樣．

1．4 主要生態(tài)因子測(cè)定

為探討細(xì)菌數(shù)量變化與主要生態(tài)因子的關(guān)系，在分析細(xì)菌數(shù)量變化的同時(shí)，也調(diào)查了主要的生態(tài)因子．根據(jù)《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》［15］，蝦池水樣的pH值、溫度和鹽度分別使用數(shù)顯pH計(jì)、溫度計(jì)和鹽度計(jì)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，其他因子在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按照規(guī)范方法測(cè)定，其中，亞硝酸鹽氮測(cè)定采用鹽酸萘乙二胺比色法，硝酸鹽氮測(cè)定采用鋅鎘還原比色法，氨氮測(cè)定采用靛酚藍(lán)分光光度法，磷酸鹽測(cè)定采用磷鉬藍(lán)分光光度法，化學(xué)需氧量（COD）測(cè)定采用堿性高錳酸鉀法，葉綠素a（Chl-a）測(cè)定采用丙酮萃取分光光度法，溶解性有機(jī)碳（DOC）測(cè)定采用TOC儀法，溶解氧（DO）采用碘量法，活性硅酸鹽采用硅鉬藍(lán)法．

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

蝦場(chǎng)細(xì)菌和弧菌的數(shù)量變化與主要生態(tài)因子的關(guān)系、以及同一樣地中水體與沉積物細(xì)菌耐藥的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，養(yǎng)殖蝦池與對(duì)照水源地間細(xì)菌和弧菌數(shù)量差異性、樣地中水體和沉積物細(xì)菌耐藥差異性及環(huán)境細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性差異均采用單因子方差分析（ANOVA，Games-Howell），細(xì)菌對(duì)不同種抗生素的耐藥性差異采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（K Independent Samples Test），統(tǒng)計(jì)過(guò)程使用SPSS 16．0軟件完成．

2 結(jié)果與分析

2．1 蝦場(chǎng)細(xì)菌和弧菌的數(shù)量分布

不同采樣時(shí)期的養(yǎng)殖蝦池及對(duì)照水源地水體和沉積物中細(xì)菌數(shù)量變化結(jié)果顯示（圖2），水中細(xì)菌數(shù)量波動(dòng)范圍為3．00×103～61．50×103cfu／mL，沉積物中細(xì)菌數(shù)量波動(dòng)范圍為3．20×104～6 002．30×104cfu／g·dw．其中，養(yǎng)殖蝦池BL1和BL2細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)大體一致，養(yǎng)殖初期細(xì)菌數(shù)量較少，隨著養(yǎng)殖時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)一個(gè)峰值（9月3日），之后細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，但收蝦期細(xì)菌數(shù)量仍多于放養(yǎng)初期細(xì)菌數(shù)量．水源地（BL4）水中細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較小，數(shù)量峰值出現(xiàn)于9月29日．沉積物中細(xì)菌數(shù)量在養(yǎng)殖蝦池（BL1、BL2）無(wú)明顯變化規(guī)律，而對(duì)照水源地BL4細(xì)菌數(shù)量波動(dòng)幅度大，并于9月3日出現(xiàn)一個(gè)異常峰值，與同期其他數(shù)據(jù)相差很大，之后又急劇回落；在第一次采樣數(shù)據(jù)顯示蝦池中細(xì)菌、弧菌數(shù)量與水源地水中均差異不顯著（ANOVA，p＞0．05），最后一次采樣中養(yǎng)殖蝦池沉積物細(xì)菌數(shù)量比水源地沉積物數(shù)量高2個(gè)數(shù)量級(jí)．

圖2 養(yǎng)殖蝦場(chǎng)中水（左）和沉積物（右）的細(xì)菌數(shù)量變化Fig．2 Variations in densities of bacteria in the water（left）and sediment（right）of shrimp farms

從放苗到收蝦的整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中沉積物和水體弧菌數(shù)量動(dòng)態(tài)變化分析結(jié)果表明（圖3），水中弧菌數(shù)量波動(dòng)范圍在0．03×103～16．60×103cfu／mL，沉積物的弧菌數(shù)量在0．15×104～78．50×104cfu／g ·dw．養(yǎng)殖初期（8月初），蝦池（BL1和BL2）水中弧菌數(shù)相對(duì)較少，8月中旬，弧菌數(shù)量緩慢上升（BL1）或者下降（BL2），隨著養(yǎng)殖時(shí)間延長(zhǎng)，BL1蝦池水中的弧菌數(shù)量急劇增加，達(dá)到峰值，之后迅速回落；而BL2和BL4蝦池水中的弧菌數(shù)量波動(dòng)幅度較?。傮w看來(lái)，收蝦時(shí)弧菌數(shù)量比放苗時(shí)弧菌數(shù)量多．養(yǎng)殖蝦池沉積物中弧菌數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定，而水源地沉積物中弧菌數(shù)量波動(dòng)幅度大，在9月初出現(xiàn)峰值．與細(xì)菌數(shù)量動(dòng)態(tài)變化情況相似，同一個(gè)蝦池沉積物中所含的弧菌數(shù)量比水中的弧菌數(shù)量高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)．

調(diào)查結(jié)果顯示，同一環(huán)境基質(zhì)中的細(xì)菌數(shù)比弧菌數(shù)高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，并且，細(xì)菌和弧菌的數(shù)量呈現(xiàn)規(guī)律性的同步增多或減少．統(tǒng)計(jì)分析表明，兩個(gè)蝦池的細(xì)菌和弧菌數(shù)量與對(duì)照水源地水平差異不顯著（ANOVA，p＞0．05）．

2．2 細(xì)菌、弧菌數(shù)量與主要生態(tài)因子的關(guān)系

細(xì)菌和弧菌與主要生態(tài)因子相關(guān)分析結(jié)果（表1、表2）顯示，BL1沉積物細(xì)菌和弧菌數(shù)均與氨氮呈顯著正相關(guān)（p＜0．05）；BL1水中弧菌數(shù)與硝酸鹽氮呈顯著正相關(guān)（p＜0．05）．蝦池細(xì)菌、弧菌數(shù)與多數(shù)調(diào)查的生態(tài)因子之間相關(guān)性不顯著（p＞0．05）．

圖3 養(yǎng)殖蝦場(chǎng)中水（左）和沉積物（右）的弧菌數(shù)量變化Fig．3 Variations in densities of vibrio in the water（left）and sediment（right）of shrimp farms

表1 細(xì)菌數(shù)量與主要生態(tài)因子的相關(guān)性Table 1 Correlation coefficient between the bacterial densities and selected ecological factors

表2 弧菌數(shù)量變化與主要生態(tài)因子的相關(guān)性Table 2 Correlation coefficient between the vibrio densities and selected ecological factors

2．3 細(xì)菌的耐藥性

蝦池水體細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），BL1細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星、多黏菌素B和左氟沙星敏感，對(duì)先鋒V表現(xiàn)出最大的耐藥性（35．48%），其次是甲氧芐胺嘧啶（22．58%），對(duì)其他抗生素則表現(xiàn)出不同程度的耐藥性．BL3細(xì)菌對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、氯霉素、萘啶酸、慶大霉素和左氟沙星7種抗生素敏感，對(duì)甲氧芐胺嘧啶、復(fù)方新諾明與氨芐青霉素3種抗生素的耐藥性均超過(guò)30%，對(duì)四環(huán)素的耐藥性近于30%，其中對(duì)氨芐青霉素的耐藥性最大為48．48%；先鋒V的耐藥率為9．09%．BL4細(xì)菌對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、萘啶酸、慶大霉素、左氟沙星6種抗生素敏感；對(duì)氨芐青霉素的耐藥性最大，為68．42%，其次是耐性百分率為31．58%的先鋒V，而對(duì)其余抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥性．

圖4 蝦場(chǎng)水體細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性（%）Fig．4 Antibiotic resistance of bacteria isolated from water samples in shrimp farm（%）

蝦場(chǎng)沉積物細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5），BL1細(xì)菌耐藥性最高的是甲氧芐胺嘧啶（37．84%），隨后依次是氨芐青霉素（32．43%）和復(fù)方新諾明（27．03%），對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、慶大霉素和左氟沙星敏感，而對(duì)四環(huán)素、先鋒V、氯霉素和萘啶酸則表現(xiàn)出10%左右的耐藥性．BL3細(xì)菌耐藥性最高的同是氨芐青霉素（38．89%），對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、萘啶酸和左氟沙星敏感，對(duì)其余6種抗生素的耐藥率均不超過(guò)20%．和水中細(xì)菌的耐藥情況相似，細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素的耐藥性最高，對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、萘啶酸、慶大霉素、左氟沙星的耐藥率最低．對(duì)照水源地BL4細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素的耐藥性最高，為80．65%，其次分別是先鋒V（54．84%）和甲氧芐胺嘧啶（48．39%），對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氯霉素與萘啶酸表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，而對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、慶大霉素和左氟沙星則敏感．

圖5 蝦場(chǎng)沉積物細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性（%）Fig．5 Antibiotic resistance of bacteria isolated from sediment samples in shrimp farm（%）

樣地水體和沉積物細(xì)菌對(duì)抗生素表現(xiàn)出相似的耐藥性譜，但分離的環(huán)境細(xì)菌對(duì)12種抗生素的耐藥性差異顯著（K Independent Samples Test，p＜0．05），細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素、甲氧芐胺嘧啶、先鋒V、復(fù)方新諾明和四環(huán)素的耐藥性顯著高于其他7種抗生素（p＜0．05）．在同一蝦池中，Pearson相關(guān)系分析顯示水體細(xì)菌耐藥性和沉積物間呈顯著正相關(guān)性（r＝0．932，p＜0．05）．對(duì)照水源地BL4沉積物中細(xì)菌耐藥性顯著高于水體（ANOVA，p＜0．05）．而在不同采樣位點(diǎn)中，對(duì)照水源地耐藥性與養(yǎng)殖蝦池中細(xì)菌耐藥性差異不顯著（ANOVA，p＞0．05）．

細(xì)菌對(duì)抗生素的多重耐藥性分析結(jié)果顯示（表3），未呈現(xiàn)對(duì)8種或8種以上抗生素同時(shí)耐藥的菌株，耐藥種類最多的是BL1沉積物細(xì)菌，MAR達(dá)到7種，最少的是BL3和BL4水體細(xì)菌，MAR為4種．所有測(cè)試樣品的細(xì)菌都存在MAR（3），MAR（4）在大部分樣品分離菌株中存在（BL1水例外）；MAR（5）同時(shí)存在于在BL1水和沉積物細(xì)菌中，BL3和BL4沉積物細(xì)菌也存在MAR（5）；最嚴(yán)重的MAR（7）出現(xiàn)在BL1沉積物細(xì)菌中．

表3 養(yǎng)殖蝦場(chǎng)中細(xì)菌對(duì)抗生素的多重耐藥性譜（%）Table 3 Profile of percentage of multiple-antibiotic-resistance among bacteria isolated from shrimp farm（%）

3 討論

放苗初期，調(diào)查結(jié)果顯示蝦池與水源地之間的細(xì)菌和弧菌數(shù)量差異小且弧菌數(shù)量偏低．在整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中蝦池水弧菌數(shù)保持在103cfu／mL左右，這與整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中未發(fā)生蝦病的情況相符［19］．本項(xiàng)研究蝦池水細(xì)菌數(shù)與弧菌數(shù)呈現(xiàn)單峰變化趨勢(shì)，養(yǎng)殖初期，細(xì)菌和弧菌的數(shù)量較低，尤其在第一次采樣時(shí)，池水和水源地中弧菌和細(xì)菌數(shù)量均差異不顯著，這可能是因?yàn)榕c放苗前蝦池經(jīng)過(guò)消毒，再引入水源地水有關(guān)［19］．在養(yǎng)殖期間，由于餌料和蝦體排泄物的積累，導(dǎo)致水體中有機(jī)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)鹽的增加［20］，使蝦池更利于細(xì)菌的繁殖生長(zhǎng)［21］，以致出現(xiàn)了細(xì)菌和弧菌數(shù)量的高峰期．隨后，會(huì)有偶爾的急劇下降，這可能與使用排毒養(yǎng)水寶和漂白粉（含氯≥30%）等藥物進(jìn)行消毒有關(guān)［19］，但總體數(shù)量高于養(yǎng)殖初期．調(diào)查樣池沉積物中的細(xì)菌數(shù)與水體有相似的變化規(guī)律且高于同期水中細(xì)菌數(shù)量1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，這與李秋芬［22］研究結(jié)果相似，緣于蝦池中細(xì)菌數(shù)量主要決定于有機(jī)物的濃度［23］，而在養(yǎng)殖池塘系統(tǒng)中，大量殘餌、生物代謝物、生物殘?bào)w等有機(jī)物不斷沉積在池底，使得底泥環(huán)境更有利于細(xì)菌繁殖生長(zhǎng)［24］，從而導(dǎo)致上述結(jié)果的產(chǎn)生．

一些研究發(fā)現(xiàn)［4－5］，蝦池細(xì)菌及弧菌的數(shù)量與部分理化因子呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)性．而本研究結(jié)果表明細(xì)菌及弧菌數(shù)量與多數(shù)生態(tài)因子之間不存在顯著的相關(guān)性，這一情況可能與蝦池養(yǎng)殖生態(tài)系受較大的人為因素影響有關(guān)，林克冰等［19］和章潔香等［25］報(bào)道了類似的現(xiàn)象．本項(xiàng)研究中，兩個(gè)蝦池的細(xì)菌和弧菌數(shù)量與對(duì)照水源地間的水平差異不顯著，與養(yǎng)殖過(guò)程中蝦池廢水直接排放至水源地有關(guān)，水源地基質(zhì)條件的改善直接刺激了細(xì)菌和弧菌種群數(shù)量的增加，從而可造成其間的水平差異不顯著［20－21］．

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)和疾病防治藥劑得以廣泛使用，致使抗生素在環(huán)境中殘留，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生［26］，遺傳基因控制和生物化學(xué)表達(dá)是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因［27］．本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，樣地分離的細(xì)菌對(duì)12種抗生素的耐藥性呈現(xiàn)顯著性差異，這與抗生素使用歷史和頻率、使用劑量和化學(xué)結(jié)構(gòu)［2］以及細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生機(jī)理［27］有關(guān)．各樣地環(huán)境細(xì)菌均對(duì)氨芐青霉素表現(xiàn)出較高的耐藥性，張瑜斌等［11］和Chelossi等［28］報(bào)道了類似的結(jié)果，BL1池水體細(xì)菌對(duì)先鋒V的耐藥性最高，原因之一可能緣于早期（上世紀(jì)80年代至90年代中期）的海水養(yǎng)殖中廣泛使用了β－內(nèi)酰胺類抗生素（包括氨芐青霉素和先鋒V），在長(zhǎng)期選擇壓力作用下使細(xì)菌產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶，使該類抗生素中β－內(nèi)酰胺環(huán)的酰胺鍵斷裂而失去殺菌活性［27］；其次，β-內(nèi)酰胺類抗生素作用的靶位位于細(xì)菌細(xì)胞壁上，而海水環(huán)境中多為革蘭氏陰性菌，該類菌細(xì)胞壁存在一層外膜，影響β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用效果，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌耐受性提高［29］．BL1沉積物細(xì)菌對(duì)甲氧芐胺嘧啶耐藥性最高，甲氧芐胺嘧啶屬于磺胺類抗生素，磺胺類是合成的抑菌藥，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制葉酸代謝循環(huán)中的對(duì)氨基苯甲酸而抑制細(xì)菌性增殖［2］，本研究調(diào)查的養(yǎng)殖蝦場(chǎng)所位于東海島，實(shí)地調(diào)查表明甲氧芐胺嘧啶在島區(qū)的對(duì)蝦海水養(yǎng)殖中使用頻繁，存在著選擇性產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性可能性，Kümmerer認(rèn)為，水生環(huán)境一些抗生素的長(zhǎng)期使用極易導(dǎo)致相應(yīng)環(huán)境耐藥細(xì)菌的發(fā)生［30］．本項(xiàng)研究中，細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星、左氟沙星、多黏菌素B均高度敏感，在毗鄰水產(chǎn)養(yǎng)殖地的高橋紅樹林區(qū)，分離的水體和沉積物細(xì)菌也呈現(xiàn)類似的現(xiàn)象［31］．環(huán)丙沙星和左氟沙星同為氟喹諾酮類抗生素，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有抗菌作用，對(duì)大部分細(xì)菌呈現(xiàn)抗菌活性，尤其是對(duì)耐藥性強(qiáng)的陰性桿菌對(duì)此類藥物仍呈現(xiàn)敏感性，不易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生［32］．多黏菌素B是多肽類抗生素，對(duì)很多革蘭陰性均有抗菌作用，除了多黏菌素E外，與其他抗菌藥物間沒有交叉耐藥且不易產(chǎn)生耐藥性［33］，故此本項(xiàng)研究中的環(huán)境細(xì)菌對(duì)多黏菌素B表現(xiàn)敏感．

BL3是發(fā)病蝦池，從圖6可以看出，此池中分離出來(lái)的細(xì)菌對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、慶大霉素和左氟沙星、氯霉素和萘啶酸這7種抗生素敏感；但對(duì)四環(huán)素、甲氧芐胺嘧啶、復(fù)方新諾明和氨芐青霉素這4種抗生素的耐藥性則明顯高于BL1和對(duì)照水源地．據(jù)了解，蝦池發(fā)病時(shí)蝦場(chǎng)主向蝦池投放了較多的漂白粉進(jìn)行消毒，消毒過(guò)程將殺滅大量的敏感細(xì)菌，而耐性高的細(xì)菌幸存，并可對(duì)四環(huán)素、甲氧芐胺嘧啶、復(fù)方新諾明和氨芐青霉素產(chǎn)生耐藥性，先前的研究表明，消毒劑等污染物的環(huán)境脅迫也可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性［26，34］．對(duì)照水源地BL4沉積物中細(xì)菌耐藥性顯著高于水體，由于沉積物環(huán)境更適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，可作為耐藥細(xì)菌和藥物殘留長(zhǎng)期的儲(chǔ)存庫(kù)［35］，在較強(qiáng)的選擇壓力作用下，加速了抗生素耐性基因在同種屬以及不同種屬細(xì)菌之間的傳播和擴(kuò)散［8］，增加了耐藥性獲得的機(jī)率，從而導(dǎo)致樣地水體和沉積物細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生相似的耐藥性譜．

本研究結(jié)果顯示，同一采樣蝦池水體和沉積物中的細(xì)菌耐藥性呈顯著正相關(guān)性，在周圍毗鄰眾多養(yǎng)殖池塘的高橋紅樹林區(qū)的研究結(jié)果也呈現(xiàn)了類似的狀況［31］，養(yǎng)殖過(guò)程含抗生素及其耐藥細(xì)菌的養(yǎng)殖廢水排放后進(jìn)入濱海濕地區(qū)域［36］，細(xì)菌的耐藥基因可通過(guò)種間水平擴(kuò)散和種內(nèi)垂直傳遞［26］，從而導(dǎo)致水體和沉積物的細(xì)菌耐藥性呈現(xiàn)了顯著的相關(guān)性．而在不同采樣位點(diǎn)中，對(duì)照水源地的細(xì)菌耐藥性與養(yǎng)殖蝦池中的細(xì)菌耐藥性差異不顯著，緣于樣地間細(xì)菌對(duì)暴露在環(huán)境中的不同種抗生素產(chǎn)生了交叉污染［14］、以及蝦池與水源地水體交換順暢，有利于細(xì)菌耐藥基因水平擴(kuò)散［30］，如此，水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)地抗生素藥物的濫用無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的選擇性發(fā)生，其耐藥性的垂直傳播和水平擴(kuò)散無(wú)疑增加了養(yǎng)殖過(guò)程細(xì)菌病害防治的難度．

受各種因素的影響，養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境細(xì)菌出現(xiàn)多重耐藥性（MAR）［14，30］．本項(xiàng)研究中（表3），產(chǎn)生的多重耐藥細(xì)菌大部分對(duì)2～5種抗生素表現(xiàn)耐藥性，但很少出現(xiàn)對(duì)6種或7種抗生素同時(shí)耐藥情況，僅在BL1沉積物中出現(xiàn)了細(xì)菌的7重耐藥性．細(xì)菌多重耐藥性的產(chǎn)生主要由于質(zhì)粒編碼、染色體突變、甚至是更小的且可移動(dòng)基因元件—轉(zhuǎn)座子的作用［37－38］．抗生素種類和使用歷史也與多重耐藥性的形成密切相關(guān)［8］．如果經(jīng)常使用某種抗生素，由于選擇壓力導(dǎo)致耐藥基因的表達(dá)，且隨著環(huán)境中抗生素殘留增加，可促進(jìn)了細(xì)菌耐藥基因垂直傳播和水平擴(kuò)散，耐藥基因一旦形成，會(huì)因擴(kuò)散引起局部區(qū)域細(xì)菌耐藥性的增高［39］．研究蝦場(chǎng)的蝦池年齡均為5年，在養(yǎng)殖的過(guò)程中通常要往蝦池中投喂大量飼料，餌料生產(chǎn)商可能會(huì)在飼料中添加少量未知類型的抗生素［40］，為了預(yù)防和治療蝦病又經(jīng)常往水中施加抗菌類藥物和漂白粉等消毒劑，如此長(zhǎng)期以往無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致蝦場(chǎng)細(xì)菌的多重耐藥性增多，故此，海水養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程當(dāng)謹(jǐn)慎使用抗菌藥物．

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了湛江東海島北寮村的高位蝦池及其水源地從放苗到收蝦的養(yǎng)殖過(guò)程水體和沉積物中的細(xì)菌數(shù)量變化及其與主要生態(tài)因子關(guān)系，并分析了該蝦場(chǎng)環(huán)境細(xì)菌對(duì)常見抗生素的耐藥性．結(jié)果表明：（1）在養(yǎng)殖過(guò)程中，蝦池水體中的細(xì)菌與弧菌數(shù)量變化呈單峰趨勢(shì)，蝦池沉積物以及水源地中細(xì)菌與弧菌數(shù)量變化無(wú)明顯的規(guī)律；（2）蝦場(chǎng)細(xì)菌、弧菌數(shù)與多數(shù)生態(tài)因子之間相關(guān)性不顯著（p＞0．05），與較大的人為擾動(dòng)因素有關(guān)；（3）樣地水體和沉積物細(xì)菌對(duì)12種抗生素的耐藥性差異顯著，其中對(duì)氨芐青霉素耐藥性最高，對(duì)左氟沙星、環(huán)丙沙星和多黏菌素B敏感，水體和沉積物細(xì)菌對(duì)抗生素表現(xiàn)出相似的耐藥性譜且兩者間呈顯著正相關(guān)（r＝0．932，p＜0．05）；（4）對(duì)照水源地耐藥性與養(yǎng)殖蝦池中細(xì)菌耐藥性差異不顯著（ANOVA，p＞0．05），與細(xì)菌耐藥性的水平擴(kuò)散和細(xì)菌對(duì)不同種抗生素產(chǎn)生交叉污染有關(guān)；（5）調(diào)查樣地的環(huán)境細(xì)菌表現(xiàn)出了較高的多重耐藥性，增加了細(xì)菌病害防治的難度．本研究結(jié)果為高位蝦池養(yǎng)殖尤其是抗菌藥物的合理使用提供了科學(xué)依據(jù)．

［1］胡夢(mèng)紅．抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，存在的問(wèn)題及對(duì)策［J］．水產(chǎn)科技情報(bào)，2006，33（5）：217－221．

［2］SARMAH A K，MEYER M T，BOXALL A．A global perspective on the use，sales，exposure pathways，occurrence，fate and effects of veterinary antibiotics（VAs）in the environment［J］．Chemosphere，2006，65（5）：725－759．

［3］劉興旺，程成榮．南美白對(duì)蝦高位池養(yǎng)殖技術(shù)［J］．廣東飼料，2010，19（8）：27－28．

［4］申玉春，熊邦喜，葉富良，等．凡納濱對(duì)蝦高位池細(xì)菌數(shù)量變化及其與水環(huán)境因子的關(guān)系［J］．海洋科學(xué)，2006，30（7）：33－37．

［5］高尚德，陳旭仁，吳以平．中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)成期間蝦池水體和底質(zhì)中細(xì)菌含量的變化［J］．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1994，18（2）：138－142．

［6］查廣方，周昌清，麥雄偉．凡納濱對(duì)蝦低鹽度高產(chǎn)蝦池環(huán)境微生物生態(tài)研究［J］．生態(tài)科學(xué)，2006，25（3）：231－235．

［7］羅 亮，李卓佳，張家松，等．對(duì)蝦精養(yǎng)池塘碳，氮和異養(yǎng)細(xì)菌含量的變化及其相關(guān)性研究［J］．南方水產(chǎn)科學(xué)，2011，7（5）：24－29．

［8］楊鳳霞，毛大慶，羅 義，等．環(huán)境中抗生素抗性基因的水平傳播擴(kuò)散［J］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，24（10）：2993－3002．

［9］陳健舜，孔 蕾，丁雪燕，等．凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌性紅體病病原的分子特征與耐藥性［J］．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36（12）：1891－1900．

［10］HELENA R R，VIANA D S O，SOUSA L A，et al．Antimicrobial resistance profile of Vibrio species isolated from marine shrimp farming environments（Litopenaeus vannamei）at Ceará，Brazil［J］．Environmental Research，2011，111（1）：21－24．

［11］張瑜斌，章 虹，柯 盛，等．不同養(yǎng)殖模式蝦池弧菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性與蝦池水質(zhì)評(píng)價(jià)［J］．廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（1）：42－47．

［12］VASEEHARAN B，RAMASAMY P，MURUGAN T，et al．In vitro susceptibility of antibiotics against Vibrio spp．a(chǎn)nd Aeromonas spp．isolated from Penaeus monodon hatcheries and ponds［J］．International Journal of Antimicrobial Agents，2005，26（4）：285－291．

［13］LE T X，MUNEKAGE Y，KATO S．Antibiotic resistance in bacteria from shrimp farming in mangrove areas［J］．Science of the Total Environment，2005，349（1－3）：95－105．

［14］TENDENCIA E A，de la PE?A L D．Antibiotic resistance of bacteria from shrimp ponds［J］．Aquaculture，2001，195（1）：193－204．

［15］GB17378．4－2007海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范（第4部分）：海水分析［S］．中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007．

［16］陳紹銘，鄭福壽．水生微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)法［M］．北京：海洋出版社，1990．

［17］張 昕，蔡俊鵬．四種海洋致病弧菌對(duì)抗生素敏感性的測(cè)定［J］．華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，31（9）：66－69．

［18］WEBSTER L F，THOMPHON B C，F(xiàn)ULTON M H，et al．Identification of sources of Escherichia coli in South Carolina estuaries using antibiotic resistance analysis［J］．Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2004，298（2）：179－195．

［19］林克冰，周 宸，蔡清海，等．斑節(jié)對(duì)蝦雙季養(yǎng)成期間蝦池水質(zhì)和底泥細(xì)菌含量的變化［J］．福建水產(chǎn)，1998，79（4）：7－12．

［20］劉少英．灘涂土池半集約化養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的生長(zhǎng)特性研究［D］．廣東海洋大學(xué)，2010．

［21］申玉春，熊邦喜，葉富良，等．凡納濱對(duì)蝦高位池養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)理化狀況［J］．湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（1）：16－21．

［22］李秋芬，陳碧鵑．魚蝦混養(yǎng)生態(tài)系中細(xì)菌動(dòng)態(tài)變化的研究［J］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13（6）：731－734．

［23］劉國(guó)才，李德尚．對(duì)蝦綜合養(yǎng)殖生態(tài)系底泥細(xì)菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)［J］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，11（1）：138－140．

［24］李爍寒，李卓佳，楊鶯鶯，等．秋冬季凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘細(xì)菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)［J］．暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，30（3）：343－348．

［25］章潔香，張瑜斌，張才學(xué)，等．高位蝦池水體細(xì)菌和弧菌的數(shù)量變化及影響因素［J］．集美大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，15（5）：327－332．

［26］ALONSO A，SANCHEZ P，MARTINEZ J L．Environmental selection of antibiotic resistance genes［J］．Environmental Microbiology，2001，3（1）：1－9．

［27］劉興旺．細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生機(jī)理的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)畜禽種業(yè)，2014，1（1）：28－29．

［28］CHELOSSI E，VEZZULLI L，MILANO A，et al．Antibiotic resistance of benthic bacteria in fish-farm and control sediments of the Western Mediterranean［J］．Aquaculture，2003，219（1）：83－97．

［29］高玉龍．南海網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)細(xì)菌耐藥性調(diào)查［D］．上海海洋大學(xué)，2013．

［30］KüMMERER K．Antibiotics in the aquatic environment-a review-part II［J］．Chemosphere，2009，75（4）：435－441．

［31］李 媛．高橋紅樹林區(qū)常用抗生素殘留及細(xì)菌耐藥性研究［D］．廣東海洋大學(xué)，2013．

［32］吳干斌，周建華，張 軍．5種喹諾酮類藥物體外抗菌活性的研究［J］．中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2014，30（2）：129－130．

［33］劉錫均．實(shí)用藥物指南［M］．北京：人民軍醫(yī)出版社，2001．

［34］WRIGHT G D．Antibiotic resistance in the environment：a link to the clinic？［J］．Current Opinion in Microbiology，2010，13（5）：589－594．

［35］MUDRYK Z J，KOSIOREK A，Perliński P．In vitro antibiotic resistance of Vibrio-like organisms isolated from seawater and sand of marine recreation beach in the southern Baltic Sea［J］．Hydrobiologia，2012，702（1）：141－150．

［36］KüMMERER K．Antibiotics in the aquatic environment-a review-part I［J］．Chemosphere，2009，75（4）：417－434．

［37］RUBAN P，GUNASEELAN C．Antibiotic resistance of bacteria from Krishna Godavari Basin，Bay of Bengal，India［J］．Environmental and Experimental Biology，2011，9（10）：133－136．

［38］肖增璜，石 磊，邱春嬋，等．多重PCR篩選臨床細(xì)菌耐藥整合子基因［J］．暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2005，26（4）：480－485．

［39］TELLO A，AUSTIN B，TELFER T C．Selective pressure of antibiotic pollution on bacteria of importance to public health［J］．Environmental Health Perspectives，2012，120（8）：1100－1106．

［40］張正丈，韓 宏．幾種替代抗生素的新型水產(chǎn)飼料添加劑［J］．科學(xué)養(yǎng)魚，2012，2（11）：71－72．

［責(zé)任編輯：劉蔚綏］

Variations in bacterial densities during culture and bacterial resistances to antibiotics in the exalted shrimp ponds at Beiliao village，on Donghai island，Zhanjiang

LI Qin，HE Yanyan，ZHANG Yubin
（Monitoring Center for Marine Resources and Environments，Zhanjiang 524088，China）

The variations in densities of bacteria and vibrio were surveyed in water and sediment samples by dilution-plate method in the exalted shrimp ponds at village Beiliao，on Donghai Island，Zhangjiang，and the bacterial resistances to 12 antibiotics were investigated simultaneously using the standard disc diffusion method．The results showed that mono-peaks were present in changes of bacteria and vibrio densities in both exalted shrimp ponds，with a top in September over sampling respectively．At the same time，no definitive patterns were found in the variations of bacterial and vibrio abundances insediment in the shrimp ponds and corresponding water source site．At BL1，the bacteria and vibrio densities showed a significantly positive correlation with the concentration of NH＋4－N in sediment（p＜0．05），while the vibrio densities were significantly positive correlated to the concentration of NO3－N in water（p＜0．05）．No significant correlation was discovered between the densities of bacteria and vibrio and other selected ecological factors（p＞0．05）in the shrimp ponds．The significant differences in bacterial resistances were found among the 12 different antibiotics（p＜0．05），with the highest resistance to ampicillin（reaching 80．65%in sediment at corresponding water source site BL4），followed by cefazolin and trimethoprim in turn，while the bacterial strains were highly sensitive to the levofloxacin，ciprofloxacin and polymyxin B．The similar profile of percentage of antibiotic-resistance were observed between bacteria isolated from water samples and those from sediment ones，and a significantly positive correlation of antibiotic-resistance of bacteria was present between them（p＜0．05）．No significant difference in bacterial resistance was found between the exalted shrimp ponds and corresponding water source site（p＞0．05），although antibiotic resistance of bacteria was significantly higher in sediment than in water at the BL4（corresponding water source site）（p＜0．05）．All bacteria isolated from three sampling sites revealed the high percentages of multiple antibiotic resistance（MAR）．

shrimp ponds；bacteria；density；antibiotics；resistance

S917．1；X55

A

1000－9965（2015）01－0011－10

10．11778／j．jdxb．2015．01．003

2014－07－14

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201305021）；廣東省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2013KJCX0095）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B020309011）

李 琴（1991－），女，研究方向：海洋微生物學(xué)與海洋生態(tài)學(xué)

張瑜斌（1970－），男，教授，博士，研究方向：海洋生態(tài)學(xué)．Tel：0759－2383378，E-mail：microyubin＠163．com．