李 萌，王桂芹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118）

植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸鹽的一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶。植酸酶具有特殊的空間結(jié)構(gòu)，能夠分離植酸分子中的磷，將植酸鹽降解為肌醇和無機(jī)磷，同時釋放出與植酸鹽結(jié)合的其他營養(yǎng)物質(zhì)（施安輝等，2005）。植酸酶可以促進(jìn)植酸鹽的水解，磷酸根可以被魚類吸收利用，對促進(jìn)魚類生長具有較好的效果（陳立僑等，1994）。因此，在飼料中添加植酸酶，即降低了飼料成本，又減輕了養(yǎng)殖水體的負(fù)擔(dān) （文華等，2008）。本試驗在全植物蛋白源的黃金鯽飼料中添加植酸酶研究對其鈣磷代謝的影響，以期為植酸酶在以植物蛋白源為主的魚飼料中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗用黃金鯽幼魚，購自二八一四漁場。試驗用植酸酶，購自上海生物工程有限公司（酶活力為5000 U/kg）。試驗共6組，對照組添加磷酸二氫鈣，試驗1～5組分別添加植酸酶0、300、600、900、1200 U/kg。

植酸酶以次粉為載體進(jìn)行稀釋 （Jackson等，1996）。采用105℃恒溫烘干法測定水分；采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)；采用550℃灼燒法測定粗灰分；采用索氏抽提法測定粗脂肪；彈式熱量計測定能量；采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法測定鈣；采用鉬黃分光光度法測定總磷。飼料有效磷的含量用飼料中總磷、植酸磷含量和植酸酶活性計算參考方熱軍等（2006）中的方法。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗魚先暫養(yǎng)15 d，期間投喂相同基礎(chǔ)飼料，待試驗魚適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后開始正式試驗。試驗共6組，每組3個重復(fù)，分別飼養(yǎng)在240 L水族箱中，每個水族箱放養(yǎng)30尾初始體重為（10.71 ±0.16）g的黃金鯽幼魚。 每天 8∶00、16∶00投喂兩次，24 h充氣，試驗飼養(yǎng)時間60 d，期間水溫為20～24℃，溶解氧＞6 mg/L。

1.2.2 樣品的采集 60 d飼養(yǎng)結(jié)束后，停食1 d，從每個水族箱中隨機(jī)取10尾魚，測定其體重、體長等，取血漿，然后在冰盤上解剖，取肝胰臟、前腸（第一個會折處以前為前腸）和背白肌等，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 消化性能指標(biāo) 蛋白酶活力的測定：將存放于-20℃冰箱中的肝胰臟和腸組織樣品解凍、剪碎，按1 g組織加入9 mL生理鹽水的比例在玻璃勻漿器中勻漿，粗酶液于4℃、5000 r/min離心10 min，取上清液備用，用考馬斯亮蘭法測定組織勻漿中蛋白質(zhì)的含量，福林-酚法測定蛋白酶活力，以蛋白酶比活力表示。

蛋白酶活性定義為在30℃、pH 7.0的條件下，1 g食糜組織中蛋白酶1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量定為一個酶活力單位（U）。

鈣磷表觀消化率的測定：待試驗進(jìn)行到第7天后，從第8天開始，分別在上午、下午投食含有0.5%Cr2O3的飼料，2 h后用虹吸法收糞便于篩網(wǎng)中，選擇新鮮、有完整包膜的糞便于清潔烘箱中，65℃干燥、粉碎后裝瓶備用，連續(xù)收集糞便10 d。

鈣的測定采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法；磷的測定采用鉬黃分光光度法。其計算公式為：

表觀消化率（ADC）=[1-（C1/C2）（N2/N1）]×100；

式中：C1為飼料中Cr2O3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；C2為糞便中Cr2O3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，N1為飼料中某元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；N2為糞便中某元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 脊柱骨鈣、磷指標(biāo)的測定 將剔除內(nèi)臟及兩側(cè)肌肉的魚體微波煮熟5 min，去掉魚頭骨及肋骨，將脊椎骨剝離干凈，于65℃烘箱內(nèi)烘24 h，室內(nèi)放置24 h制備成風(fēng)干樣，分析魚體和椎骨主要成分。鈣、磷測定方法同1.3.1。

1.3.3 血液生化指標(biāo)的測定 血漿的制備：每組隨機(jī)取10尾魚于冰盤內(nèi)取血，迅速轉(zhuǎn)移至抗凝管中，與抗凝劑充分混合，放入離心機(jī)中3000 r/min離心5 min，取上清保存于-20℃冰箱中。

血漿鈣、磷、堿性磷酸酶活力的測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，測定步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.4 氮、磷排泄的測定 試驗第10天開始，每天10∶00和18∶00兩次測定水中氨氮和磷酸鹽的含量，連續(xù)測量7 d。

水中氨氮和磷酸鹽的測定采用陸恒生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，測定步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

排泄率（U）=V×[（ρ2-ρ20）-（ρ1-ρ10）]/（t×m）；

式中：U 表示排泄率，mg/kg·h；V 為代謝缸中水的總體積，L；ρ1、ρ2為初始水樣與終末水樣的氨氮濃度，mg/L；ρ10、ρ20為初始與終末時空白對照缸中水樣氨氮濃度，mg/L；m為試驗魚體質(zhì)量，kg；t為初始水樣與終末水樣間隔的時間，h。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s多重比較分析組間差異顯著性程度。試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 植酸酶對黃金鯽消化的影響 由表2可知，隨著各試驗組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，腸道蛋白酶活力有升高的趨勢，在試驗添加到900 U/kg時，腸道蛋白酶比活力較試驗1組提高15.78%（P＜0.05）；且與對照組差異不顯著（P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，腸道蛋白酶比活力不再顯著升高；肝胰臟蛋白酶比活力受飼料中植酸酶水平的影響不顯著。

表2 飼料植酸酶水平對黃金鯽蛋白酶比活力的影響

由表3可知，隨著各試驗組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，鈣、磷表觀消化率也有升高的趨勢，當(dāng)植酸酶含量添加到900 U/kg時，鈣、磷表觀消化率較試驗1組分別提高6.48%和14.17%（P＜0.05），且與對照組差異不顯著 （P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，鈣、磷表觀消化率不再顯著升高。

表3 飼料植酸酶水平對黃金鯽鈣、磷表觀消化率的影響

2.2 植酸酶對黃金鯽鈣、磷沉積，血液生化指標(biāo)和氮、磷排泄的影響 由表4可知，隨著各試驗組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，骨鈣和骨磷有升高的趨勢，在試驗添加到900 U/kg時，骨鈣和骨磷分別較試驗1組提高13.23%和4.93%（P＜0.05），且與對照組差異不顯著 （P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，骨鈣和骨磷不再顯著升高。

表4 飼料植酸酶水平對黃金鯽脊椎骨鈣、磷的影響 %

由表5可知，隨著各試驗組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，血鈣有升高的趨勢，在試驗添加到600 U/kg時，血鈣較試驗1組高61.61%（P＜0.05），且與對照組差異不顯著 （P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，血鈣不再顯著升高；隨著各試驗組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，血磷有升高趨勢，在試驗添加到900 U/kg時，血磷與對照組差異不顯著 （P＞0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，血磷顯著升高；各試驗組黃金鯽血中堿性磷酸酶差異不顯著。

表5 飼料植酸酶水平對黃金鯽血鈣、血磷和血中堿性磷酸酶的影響

由表6可知，隨著各試驗組黃金鯽飼料中植酸酶添加量的逐漸升高，氨氮和磷酸鹽有降低的趨勢，在試驗添加到900 U/kg時，氨氮和磷酸鹽分別較試驗 1組降低 19.68%和 13.47%（P＜0.05），且與對照組差異不顯著（P ＞ 0.05），隨著植酸酶添加劑量的繼續(xù)增加，氨氮和磷酸鹽不再顯著降低。

表6 飼料植酸酶水平對黃金鯽氮、磷排泄的影響 mg/kg·h

3 討論

3.1 植酸酶對黃金鯽消化的影響 水生動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化通常以化學(xué)消化為主，即需要酶的參與。腸道酶活力的高低也代表水生動物消化能力的強(qiáng)弱，特別是在無胃魚中，腸道酶活力更是重要的評定指標(biāo)。腸道蛋白酶是魚類消化酶中最重要的酶。胰腺是水生動物重要的消化腺，主要分泌蛋白酶原，其發(fā)育狀況直接體現(xiàn)酶原分泌狀況。Biswas等（2007）在對紅鯛的研究表明，當(dāng)試驗魚肝胰臟的重量和肝體比顯著增加時，試驗魚的生長狀況良好。Liebert和Portz（2005）在對尼羅羅非魚的試驗研究也發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶是唯一一種能夠顯著影響試驗魚特定生長率以及飼料利用率的消化酶。本試驗在黃金鯽飼料中添加900 U/kg植酸酶顯著提高了腸道蛋白酶活性。這與張璐等（2009）對大黃魚的胃和腸道蛋白酶活性變化的研究一致。這表明在黃金鯽飼料中添加900 U/kg時，能提高黃金鯽的消化能力。

植酸可與磷形成不可溶二價或多價陽離子鹽，與銅、鈷、鋅、錳、鎂和鐵形成復(fù)合物，與蛋白質(zhì)和氨基酸絡(luò)合，從而使這些營養(yǎng)物質(zhì)不能被魚體利用。加入植酸酶可消除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高魚體對飼料中各營養(yǎng)物質(zhì)的消化率（姚瑞清等，2008）。本試驗在黃金鯽飼料中添加600 U/kg植酸酶顯著提高了鈣、磷表觀消化率。這與程宗佳（2004）在虹鱒的豆粕型飼料中添加不同水平的植酸酶，顯著提高了虹鱒的表觀消化率的結(jié)論相一致。

3.2 植酸酶對黃金鯽鈣磷代謝、排泄和沉積的影響 測量植酸酶對血漿中礦物質(zhì)元素含量的影響是衡量植酸酶改善魚類礦物質(zhì)元素吸收利用率最可靠、最敏感的方法之一。低血鈣可以引起魚體骨鈣的迅速釋放，然而低血磷就不易使魚體中的骨磷釋放出來。因此，對魚類來講低血磷就意味著缺磷，會引起骨營養(yǎng)不良，表現(xiàn)為骨灰分占骨總重量的百分比下降。本試驗在黃金鯽飼料中添加600 U/kg（鈣磷比為1∶1）植酸酶顯著提高了黃金鯽血鈣含量，但血磷含量變化差異不顯著。試驗證明飼料中添加植酸酶對試驗魚血漿中鈣、磷含量有影響，但差異不顯著。血漿堿性磷酸酶（AKP）的活性受血磷濃度影響。血磷濃度降低時，破骨細(xì)胞活動增強(qiáng)，使骨鹽降解并釋放入血，同時也使腎臟對磷的重吸收增強(qiáng)，致使魚體血液中游離的鈣和磷濃度均提高。而血鈣升高則引起降鈣素分泌，使成骨細(xì)胞活動增強(qiáng)，AKP釋放量增加，破壞骨組織附近Ca2+和PO43－的過飽和狀態(tài)，使之沉積。因此，血漿AKP活性升高，說明動物處于缺磷狀態(tài)。本試驗在黃金鯽飼料中添加植酸酶并未顯著影響黃金鯽血中堿性磷酸酶的含量，但隨著植酸酶的添加量升高，血漿AKP的數(shù)值略有下降，表明黃金鯽飼料中添加植酸酶可緩解魚體缺磷的狀態(tài)。Sugiura等（1999）用不同含磷量的飼料飼養(yǎng)虹鱒的試驗結(jié)果也表明，不管是在血漿中還是在腸道中，堿性磷酸酶活性與飼料含磷量多少無關(guān)，這與本試驗研究的結(jié)果基本一致。

氮和磷是造成養(yǎng)殖水體的重要污染物之一。氨氮（NH3-N）和磷酸鹽（PO43-）是魚類排泄磷的主要形式，因此氨氮和磷酸鹽的排泄也就常作為對魚類排泄評價的指標(biāo)。本試驗在黃金鯽飼料中添加900 U/kg植酸酶顯著提高了黃金鯽脊椎骨鈣、磷含量。主要由于植酸酶降解飼料中植酸時，降低植酸與飼料中蛋白質(zhì)的絡(luò)合作用，同時提高魚體內(nèi)源性蛋白酶的活性，使蛋白質(zhì)的消化吸收率提高，從而降低氮的排泄率（劉曉俠，2009）。這一結(jié)論與楊雨虹等（2009）對金鱒的研究結(jié)果一致。但周秋白（2001）在對大黃魚和鱸魚飼料中添加植酸酶的研究得知，植酸酶可以降低試驗魚磷的排泄率，其主要原因可能是魚體所吸收的磷已超過其需求量，隨飼料中磷的不斷增加，磷的排泄率也就會有所增加。

脊椎骨鈣、磷沉積的測定是評價植酸酶改善魚體礦物質(zhì)元素吸收利用的重要指標(biāo)之一。楊雨虹等（2009）采用噴涂法將植酸酶添加到飼料中，顯著提高金鱒的椎骨鈣、磷含量同時也促進(jìn)肌肉中鈣、磷的沉積。Jackson等（1996）發(fā)現(xiàn)，在斑點叉尾鮰飼料中添加植酸酶能夠提高磷在試驗魚骨骼中的沉積，同時排泄物中磷的含量隨植酸酶的添加而減少。本試驗在黃金鯽飼料中添加900 U/kg植酸酶顯著提高了黃金鯽脊椎骨鈣含量。這與Fortes（2011）對歐洲鱸的試驗結(jié)果一致。Nwanna等（2007）對鯉魚試驗研究也表明，隨飼料中植酸酶添加量升高，脊椎骨鈣沉積量逐漸增加。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，黃金鯽全植物蛋白源飼料中添加適宜植酸酶可提高黃金鯽對磷的利用率，達(dá)到對照組（適宜的鈣磷比）鈣磷代謝的水平。在本試驗條件下，植酸酶在黃金鯽全植物蛋白源飼料中的適宜添加量為600～900 U/kg。

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