田雨,侯玉柱,柯潤輝,尹建軍,宋全厚
(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100027)
ATP生物發(fā)光法是新近發(fā)展起來的一種微生物快速檢測技術[1],具有快速、簡單、經(jīng)濟的特點[2],目前主要應用在食品生產(chǎn)企業(yè)的日常衛(wèi)生管控方面[3-4],它與涂抹法結合可快速測定食品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)各個衛(wèi)生關鍵控制點的衛(wèi)生狀況[5-6],快速評估,及時發(fā)現(xiàn)問題,降低微生物污染發(fā)生的可能性[7-8]。
由于ATP生物發(fā)光法無法定性鑒別細菌種類[9-12],因此不同細菌 ATP 含量是否一致[13-14],對該方法的檢測結果影響較大。鑒于此,本研究以ATP生物發(fā)光法為基礎,輔以GB4789.2-2010方法,選擇大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸片球菌等6種常見細菌,分析和對比不同常見細菌中ATP含量的差異性。
1.1.1 實驗菌株
大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234);枯草芽孢桿菌(CICC10275);蠟狀芽孢桿菌(CICC20511);乳酸鏈球菌(CICC20711);乳酸片球菌(CICC20719)。
1.1.2 儀器與試劑
ATP熒光檢測儀(SF0012型),購于中質賽福(北京)科技儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱;渦旋振蕩器;高壓滅菌鍋。
ATP標準品(三磷酸腺苷二鈉鹽);復合熒光試劑(產(chǎn)品編號ZF0011),購于中質賽福(北京)科技儀器有限公司;平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA);無菌生理鹽水;無菌水。
1.2.1 建立6株細菌的菌落總數(shù)(CFU/mL)與ATP熒光值(RLU/50μL)的數(shù)學模型
自冷藏的斜面培養(yǎng)基中挑取6株細菌——大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢桿菌(CICC10275)、蠟狀芽孢桿菌(CICC20511)、乳酸鏈球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719),分別劃線接種于培養(yǎng)皿中,36℃培養(yǎng)24 h。將10 mL無菌生理鹽水注入已劃線培養(yǎng)24 h的平皿培養(yǎng)基表面,打散其上的菌落并收集于無菌玻璃試管中,振蕩搖勻,作為菌懸液原液。吸取每株細菌的菌懸液原液各1 mL放入無菌玻璃試管中,加4 mL生理鹽水混合均勻,配制成稀釋度為10-1的6株細菌的混合液。以無菌生理鹽水10倍梯度稀釋各細菌的菌懸液原液及其混合液,配制成10-1~10-8梯度稀釋菌液。吸取 10-6、10-7、10-8梯度稀釋菌液各 1 mL,按照GB4789.2-2010測定其菌落總數(shù)。再吸取各菌株及其混合菌液的梯度稀釋液各50 μL于樣品杯中,加25 μL復合熒光試劑,放入ATP熒光檢測儀中測定其熒光值。以菌液的菌落總數(shù)(CFU/mL)及ATP熒光值(RLU/50μL)建立數(shù)學模型。
1.2.2 建立ATP標準溶液濃度與其熒光值的數(shù)學模型
稱取ATP標準品0.055 1 g,以無菌水定容于100 mL容量瓶,即得10-6mol/mL的ATP基礎溶液。吸取ATP基礎溶液1 mL,以無菌水定容于100 mL容量瓶,即得10-8mol/mL的ATP基礎稀釋溶液。對10-8mol/mL的ATP基礎稀釋溶液進行10倍梯度稀釋,配制濃度為10-9~10-13mol/mL的ATP標準系列溶液。吸取ATP標準系列溶液各50 μL于樣品杯中,加25 μL復合熒光試劑,以微量熒光檢測儀測定其熒光值。根據(jù)ATP標準系列溶液的濃度(mol/mL)與相應的熒光值(RLU/50μL),建立數(shù)學模型。
分別測定大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢桿菌(CICC10275)、蠟狀芽孢桿菌(CICC20511)、乳酸鏈球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)等6株細菌的ATP熒光值和菌落總數(shù),由于每次可測得5~6對數(shù)據(jù),為獲得統(tǒng)計學中的大樣本數(shù)量(n≥30),多次重復測定,保證每株細菌測得30對或30對以上的數(shù)據(jù)用于建立數(shù)學模型。表1內是6株細菌及其混合菌液的菌落總數(shù)對數(shù)值[log10(CFU/mL)]與ATP熒光值對數(shù)值[log10(RLU)]的數(shù)學模型,由表1的數(shù)學模型,可計算出6株細菌在相同熒光值下對應的菌落總數(shù),見表2。
表1 六株細菌的菌落總數(shù)與ATP熒光值的數(shù)學模型Table 1 Mathematical models between aerobic plate count and ATP fluorescence value of six strains
表2 六株細菌及其混合物在不同ATP熒光值下的菌落總數(shù)CFU/mLTable 2 Aerobic plate counts of six strains and their mixture with different ATP fluorescence values CFU/mL
由表2可知,當熒光值為100時,6株細菌及其混合物的菌落總數(shù)基本維持在104CFU/mL左右,并且隨著熒光值的10倍遞增,菌落總數(shù)也呈現(xiàn)10倍遞增趨勢,當熒光值達到1 000 000(儀器的最大量程為7位數(shù))時,菌落總數(shù)始終保持在108CFU/mL的水平。因此,當熒光值相同時,無論是單一純菌樣品還是含有多種混合細菌的樣品,其菌落總數(shù)都保持在相同或相近的數(shù)量級上。
為了進一步確認在ATP熒光值均相同的情況下,6株細菌及其混合菌液的菌落總數(shù)是否存在明顯差異,對表2中6株細菌的菌落總數(shù)進行無重復的雙因素方差分析,結果見表3。
由表 3可知,F(xiàn)行=8.13>F行crit=2.87,P=4.62×10-4<0.05,表示當 ATP熒光值(在100~1 000 000RLU/50 μL范圍內)數(shù)量級不同時,實驗所用的6株細菌的菌落總數(shù)有明顯差異。即ATP熒光值的數(shù)量級對各細菌的菌落總數(shù)有顯著影響。而F列=1.31<F列crit=2.71,P=0.30>0.05,表示當 ATP熒光值(在100~1 000 000 RLU/50μL范圍內)相同時,各細菌的菌落總數(shù)無顯著差異。即細菌的種類雖然會導致ATP生物發(fā)光法所測得的菌落總數(shù)各不相同,但差異并不明顯,不會對菌落總數(shù)的報告結果產(chǎn)生顯著影響。
表3 六株細菌在相同熒光值下的菌落總數(shù)的無重復雙因素方差分析CFU/mLTable 3 No repeat two-way ANOVA of aerobic plate counts of six strains and their mixture with same ATP fluorescence value CFU/mL
表4 ATP標準溶液濃度與相應的熒光值Table 4 Concentration of ATP standard solution and their fluorescence value
根據(jù)ATP濃度的對數(shù)值和熒光值的對數(shù)值建立數(shù)學模型,如圖1。
圖1 ATP標準溶液濃度與其相應熒光值的數(shù)學模型Fig.1 A mathematical model between concentration of ATP standard solution and their fluorescence values
可知ATP含量與其熒光值的相關數(shù)學模型為:
Y=0.968 5X+15.443 4
其中,Y為ATP熒光值的對數(shù)值[log10(RLU)];X為ATP標準溶液濃度的對數(shù)值[log10(mol/mL)];二者相關系數(shù)(R2)為0.994 3,數(shù)學模型線性良好。
將ATP濃度與熒光值的數(shù)學模型Y=0.968 5X+15.443 4(見圖1)代入表1中的6株菌落總數(shù)與熒光值的數(shù)學模型,可推導出株菌落總數(shù)對數(shù)與ATP濃度對數(shù)值的數(shù)學模型,見表5。
表5 六株細菌的菌落總數(shù)與ATP含量的數(shù)學模型Table 5 Mathematical models between aerobic plate count and ATP content
根據(jù)表5中的數(shù)學模型,可計算不同菌落總數(shù)水平下的各細菌ATP含量(mol)。但由于受本研究所使用的ATP熒光檢測儀量程所限(見表2),僅選取104~108CFU/mL(與ATP熒光檢測儀100~1 000 000 RLU的量程相對應)共5個數(shù)量級的菌落總數(shù),代入表5的數(shù)學模型進行計算。
表6 六株細菌在不同菌落總數(shù)下的ATP含量Table 6 ATP contents of six strains with different aerobic plate counts
由表6可知,6株細菌的ATP含量均隨菌落總數(shù)的10倍增長而逐級提高,當菌落總數(shù)為104CFU/mL時,6種細菌的ATP總量基本都在10-14mol/mL的水平。當菌落總數(shù)為108CFU/mL時,6種細菌的ATP總量基本都在10-10mol/mL的水平。雖然大部分細菌的ATP總量并不是絕對嚴格地隨菌落總數(shù)的10倍遞增,其兩位有效數(shù)字往往有所不同;但當菌落總數(shù)相同時,各細菌的ATP含量都在相同或相近的數(shù)量級上。
為確定在菌落總數(shù)均相同的情況下,6株細菌的ATP總含量是否存在顯著差異,對表6中的數(shù)據(jù)進行無重復的雙因素方差分析,結果如下:
由表7可知,F(xiàn)行=10.11>F行crit=2.87,P=1.21×10-5<0.05,表示當菌落總數(shù)的數(shù)量級(1~108CFU/mL)不同時,實驗所用的6株株細菌的ATP總含量有明顯的差異。即菌落總數(shù)的數(shù)量級對各細菌的ATP總含量有顯著影響。而F列=1.24<F列crit=2.71,P=0.33>0.05,表示當菌落總數(shù)相同時,不同細菌的ATP含量無明顯差異。即細菌的種類不會對ATP生物發(fā)光法所測得的各細菌的ATP總含量產(chǎn)生顯著影響。而根據(jù)圖1中的數(shù)學模型,ATP含量與其熒光值線性相關(R2=0.994 3),因此雖然6株細菌種屬不同,但當其菌落總數(shù)相同時,所測定的ATP熒光值無明顯差異。
表7 六株細菌在不同菌落總數(shù)下的ATP含量的無重復因素方差分析mol/LTable 7 No repeat two-way ANOVA of ATP contents of six strains with different aerobic plate counts mol/L
目前,對ATP生物發(fā)光法的研究,多集中在溫度、pH值、提取劑等外在因素對微生物檢測結果的影響[15-16],關于不同種類細菌中ATP含量的研究較為稀少[17]。張國龍[18]、張虹妍[19]等為了驗證抗結核藥物的作用,曾以ATP生物發(fā)光法測定結核分枝桿菌的ATP含量,但并未橫向比對不同細菌種類之間的差別。本研究分析和比對了大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸片球菌等6株常見細菌的ATP含量,這對ATP生物發(fā)光法的實際應用具有重要意義——在使用該方法快速檢測樣品的細菌數(shù)量時,可以忽略體積相似或相近的細菌的種屬差異,根據(jù)數(shù)學模型推算菌落總數(shù),為食品生產(chǎn)加工企業(yè)的衛(wèi)生管控提供快速、準確的技術支撐。
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