白飛榮，李輝，姚粟，劉洋，張露，扎西才吉，程池

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

2(玉樹藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司，四川玉樹，810003)

冬蟲夏草［Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung，J.M.Sung，Hywel-Jones ＆ Spatafora］［1］是冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上形成的子座及僵蟲(幼蟲尸體、菌核)的復(fù)合體，主要生長于我國的四川、青海、云南、西藏和甘肅等省區(qū)海拔3 500～5 000 m的高山灌叢和草甸中。

青海省蟲草資源非常豐富，數(shù)量和質(zhì)量均居全國之冠。其中處于三江源核心區(qū)的玉樹冬蟲夏草產(chǎn)量占青海省總產(chǎn)量的60%以上，所產(chǎn)的冬蟲夏草個(gè)頭大、質(zhì)量好，是我國最重要的冬蟲夏草來源地。本研究對(duì)玉樹產(chǎn)地冬蟲夏草主要化學(xué)成分進(jìn)行較全面的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品收集

新鮮冬蟲夏草于2013年5月采自青海玉樹藏族自治州的郭欽(海拔5 100 m)和哈秀鄉(xiāng)(海拔4 800 m)。

1.1.2 樣品處理

新鮮冬蟲夏草在室內(nèi)陰干，利用組織研磨器研碎過60目篩，過篩粉末用于成分研究的提取與測(cè)定，所有試驗(yàn)均設(shè)置重復(fù)組，取平均值。

1.1.3 主要試劑與儀器

腺苷、蟲草酸、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純，中國食品藥品檢定研究院)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(分析純，Sigma公司)，無水乙醇、苯酚、濃H2SO4(均為分析純)，甲醇(色譜純)，自制雙蒸水。

高溫電爐(SXZ-8-10)，上海一恒科技有限公司;電子分析天平(FA-B)，上海精密儀器有限公司;分光光度計(jì)(DU-800)，島津LC-20A高效液相色譜儀(SHIMADZU);SE812J氮吹儀，北京帥恩科技有限責(zé)任公司;原子吸收光譜儀(AA-240S)，美國VARIAN;組織研磨儀(TL-2010)，北京艾科塞恩斯有限公司;超聲波振蕩器(JY92-IIN)，寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 測(cè)定方法及原理

1.2.1 水分、灰分和蛋白質(zhì)測(cè)定方法

水分采用GB 5009.3-2010進(jìn)行測(cè)定;灰分采用GB5009.4-2010進(jìn)行測(cè)定;蛋白質(zhì)采用GB 5009.5-2010進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 氨基酸測(cè)定方法

采用GB 5009.124-2003進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 無機(jī)元素測(cè)定方法

Fe、Mg、Mn:GB/T5009.90-2003;K、Na:GB/T5009.91-2003;Zn:GB/T5009.14-2003;Ca:GB/T5009.92-2003;Cu:GB/T5009.13-2003;Pb:GB 5009.12-2010。

1.2.4 粗多糖測(cè)定方法［2］

采用苯酚-硫酸分光光度測(cè)定法，乙醇沉淀得到多糖組分，在濃H2SO4作用下脫水生成的糠醛衍生物能與苯酚縮合成橙紅色化合物，其呈色強(qiáng)度與溶液中多糖濃度成正比，在485 nm處有最大吸收峰，故可在此波長下進(jìn)行比色定量。

1.2.5 蟲草素(C10H13N5O3)和腺苷(CC10H13N5O4)的測(cè)定方法

采用高效液相方法測(cè)定，色譜柱:Shim-pack VPODS 250 mm × 4.6 mm，5 μm;檢測(cè)器:VWD-3000RS，檢測(cè)波長254 nm;流動(dòng)相:V(水)∶V(甲醇)=88∶12;流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL，用紫外檢測(cè)器來測(cè)定蟲草素和腺苷的含量。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)［3-4］。

1.2.6 蟲草酸(D-甘露醇)的測(cè)定方法

采用高效液相方法測(cè)定，色譜柱:糖類和有機(jī)酸分析柱300 mm ×7.8 mm(8%)，8 μm;檢測(cè)器:RID 40℃;流動(dòng)相:0.002 5 mol/L H2SO4;流速:1.0 mL/min;柱溫:80℃;進(jìn)樣量:20 μL，根據(jù)保留時(shí)間定性，用示差檢測(cè)器來測(cè)定蟲草酸的含量。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)［4］。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分、灰分、蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)1.2.1方法進(jìn)行測(cè)定，具體結(jié)果見表1。測(cè)定結(jié)果顯示2個(gè)樣品中水分、灰分、蛋白質(zhì)含量大致相同。

表1 冬蟲草夏草原草基礎(chǔ)成分測(cè)定結(jié)果Table 1 The results of basic ingredient from nature O.sinensis

2.2 氨基酸測(cè)定結(jié)果

通過1.2.2方法對(duì)18種氨基酸進(jìn)行測(cè)定(結(jié)果見表2)。由結(jié)果可知，2個(gè)樣品中氨基酸總量基本一致，且同一種氨基酸含量均沒有較大的差異，所有氨基酸中谷氨酸含量最高(達(dá)到3.68%)，蛋氨酸含量最低。

2.3 無機(jī)元素測(cè)定結(jié)果

根據(jù)國標(biāo)GB/T5009方法對(duì)9種無機(jī)元素進(jìn)行測(cè)定(結(jié)果見表3)，2個(gè)蟲草樣品間除Mn和Pb元素含量差別較大外，其他元素含量無明顯差異，2個(gè)樣品均以K元素含量最高(達(dá)到1.55×104mg/kg)。

表2 氨基酸測(cè)定結(jié)果 %Table 2 The determination results of amino acids

表3 無機(jī)元素的測(cè)定結(jié)果 mg/kgTable 3 The determination results of inorganic elements

2.4 多糖、腺苷、蟲草素、蟲草酸測(cè)定結(jié)果

根據(jù)1.2.4～1.2.6的方法對(duì)多糖、腺苷、蟲草素、蟲草酸進(jìn)行測(cè)定(結(jié)果見表4)。多糖測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=4.188 3x+0.005 2(R2=0.998 0)，x代表多糖(mg)，y代表吸光度;腺苷檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=0.497 69x+0.034 85(R2=0.999 9)，x代表腺苷濃度(μg/mL)，y代表峰面積(mAU·min);蟲草酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y=5.199 23x-0.036 79(R2=0.999 8)，x代表蟲草酸濃度(mg/mL)，y代表峰面積(μRIU/min)。測(cè)定結(jié)果顯示2個(gè)樣品多糖含量無明顯差異，郭欽樣品的腺苷和蟲草酸含量相對(duì)較高(分別為0.33 mg/g，131.75 mg/g)，2樣品中均未有蟲草素檢出。

表4 功效成分測(cè)定結(jié)果Table 4 The determination results of functional components

3 討論

文中測(cè)定得到玉樹州2個(gè)產(chǎn)地冬蟲夏草的灰分為(4.6% ～4.7%)、粗蛋白為(31.57% ～33.75%)、總氨基酸為(23.12% ～23.73%)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致，粗多糖含量(10.53% ～11.19%)略低于相關(guān)文獻(xiàn)中的測(cè)定結(jié)果(12% ～28%)［5-8］。

腺苷的測(cè)定結(jié)果(0.18～0.33 mg/g)與李紹平［9］毛細(xì)管電泳法分析四川、西藏冬蟲夏草樣品的結(jié)果(0.1～0.3 mg/g)相吻合，且符合《中國藥典》(2010)規(guī)定的冬蟲夏草腺苷含量不得低于0.01%的規(guī)定。蟲草酸測(cè)定結(jié)果(105.34～131.75 mg/g)，與周蘇等［10］青海蟲草的測(cè)定結(jié)果(115.99 mg/g)相吻合。無機(jī)元素測(cè)定結(jié)果中鐵的含量(1 220～1 350 mg/kg)高于周蘇［10］等的測(cè)定結(jié)果(云南 660 mg/kg，西藏791 mg/kg，青海734 mg/kg)近1倍，原因可能與蟲草采集地的土質(zhì)情況有關(guān)聯(lián)，其他元素的測(cè)定結(jié)果與張曉峰［11］等《中國蟲草》內(nèi)收集的各地蟲草樣品測(cè)定結(jié)果基本吻合。

本實(shí)驗(yàn)的2個(gè)樣品中未檢測(cè)到蟲草素，此結(jié)果與周蘇等［10］的測(cè)定結(jié)果一致，其只在蛹蟲草中檢測(cè)到蟲草素，在西藏、云南、青海的冬蟲夏草樣品中均未檢測(cè)到，可能與提取方法有關(guān)或者是冬蟲夏草代謝產(chǎn)生的這種化合物原本含量就較低。

［1］ Sung G H，Hywel-Jones N L，Sung J M，et al.Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi［J］.Studies in Mycology，2007(01)，57:5-59.

［2］ NY/T 1676-2008.食用菌中粗多糖含量的測(cè)定［S］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社出版，2008.

［3］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(第一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:附錄36-37.

［4］ 顧振宇，吳雪美，張虹，等.高效液相色譜法測(cè)定冬蟲夏草中蟲草素和蟲草酸的含量［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2007，7(3):144-147.

［5］ 李楠，宋健國，劉金云，等.蛹蟲草與冬蟲夏草的化學(xué)成分比較［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，17(增刊):80-83.

［6］ 彭國平，李紅陽，袁永泰.冬蟲夏草與人工蛹蟲草的成分比較［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，12(5):26-27.

［7］ 胡敏，皮惠敏，鄭元梅.冬蟲夏草的化學(xué)成分及藥理作用［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(11):2 804-2 806.

［8］ 嚴(yán)冬，梁舉春.冬蟲夏草化學(xué)成分研究綜述［J］.黑龍江科技信息科技論壇，2013(5):96.

［9］ 李紹平，李萍，季暉，等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定冬蟲夏草中核苷類的含量［J］.藥物分析雜志，2001，21(2):77-79.

［10］ 周蘇，邢增濤.冬蟲夏草及蟲草制品中活性成分檢測(cè)方法的建立及含量測(cè)定［D］.上海:上海海洋大學(xué)，2013:7-60.

［11］ 張曉峰，劉海清，黃立成，等.中國蟲草［M］.西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社，2008.