魏春，顏雨薇，張艷麗，汪釗

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

在我國的蛋白原料資源中，棉籽粕占有極其重要的地位，年產(chǎn)總量超過600萬t，居全球首位［1］。限制棉籽粕大量用于飼料的主要因素是其含有棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子。棉酚(gossypol)俗稱棉毒素，是存在于棉籽色素腺體中的一種毒素。在有腺體棉籽中，棉酚約占棉仁質(zhì)量的0.49% ～1.87%［2］。飼用棉籽粕最重要的一步處理，就是降低棉籽粕中棉酚的含量，特別是降低游離棉酚的含量。微生物發(fā)酵是降低棉酚含量的一種有效方法［3-5］。

棉籽粕中低聚糖主要是棉籽糖和水蘇糖，含量分別約為6.91%和2.36%［6］。由于棉籽糖含有α-半乳糖苷鍵，而單胃動物缺乏α-半乳糖苷酶，無法被消化利用。大量棉籽糖的存在會影響動物對蛋白質(zhì)的消化率、生長性能和動物腸道食糜通過速度等。因此，從棉籽粕中提取棉籽糖，可以提高提取后棉籽粕的飼用品質(zhì)，同時可得到功能性低聚糖產(chǎn)品棉籽糖。

本研究將棉籽糖提取與提取后棉籽粕的固態(tài)發(fā)酵相結(jié)合，建立棉籽粕聯(lián)合加工工藝。使用棉籽糖提取后的棉籽粕作為發(fā)酵原料，在提取得到棉籽糖的同時，也去除了部分棉酚。通過混合菌固態(tài)發(fā)酵進一步減少了棉籽粕中的棉酚含量，脫毒率達到飼用標(biāo)準(zhǔn)，棉籽粕飼用品質(zhì)得以改善。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

棉籽粕:購于新疆石河子，粉碎，過60目篩。

菌株:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum WZ011，CCTCC No:M 2011364)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermenti WZW004)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae WZW005)，均為實驗室保藏菌株。

植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌種子培養(yǎng)基(MRS):蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸出粉5 g、葡萄糖20 g、無水醋酸鈉5 g、檸檬酸二銨 2 g、吐溫-80 1 mL、MgSO40.58 g、MnSO40.25 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH為6.2～6.4，115℃滅菌30min。

釀酒酵母種子培養(yǎng)基(YPD):酵母浸出粉l0 g、蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1 L，pH為7.0～7.2，115℃滅菌30 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:將粉碎過篩后的棉籽粕或經(jīng)提取加工后的棉籽粕與麩皮60℃烘干至恒重，按9∶1質(zhì)量比混合均勻，按料水比1∶1.2(w/w)添加含無機鹽的水溶液。無機鹽水溶液組成(L):2 g NaNO3，1 g MgSO4·7H2O，2 g K2HPO4，1 g NaCl，2 g FeSO4，0.6 g MnSO4和 0.4 g CuSO4·7H2O，pH 6.0。

植物水解酶(諾維信Viscozyme L)購自北京華章未央生物科技有限公司，含果膠裂解酶和各種碳水化合物酶，包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶，酶活力為100 FBG/g;木瓜蛋白酶購自南寧龐博生物工程有限公司，酶活力100萬u/g。

1.2 實驗方法

1.2.1 棉籽粕預(yù)處理及棉籽糖的提取

酶預(yù)處理條件:在20 g棉籽粕中加入30 mL水，pH值調(diào)至5.5，再直接加入適量酶(棉籽粕質(zhì)量的0.1%)，溫度50℃，攪拌水解2 h。

取粉碎過篩的棉籽粕20 g，置于保溫反應(yīng)器中，加入70 mL的75%乙醇溶液，50℃攪拌狀態(tài)下浸提一段時間后，靜置5 min，傾出上層清液，再加入70 mL的乙醇溶液進行浸取，提取料液比1∶14(g∶mL)，浸出時間2 h。浸提4次后，8層紗布過濾，合并得到提取液總體積［7］。

以含1.4 mol/L檸檬酸(或其他酸)的75%乙醇溶液提取棉籽糖:首先配置1.4 mol/L的檸檬酸(或其它酸)溶液，再加入一定量的無水乙醇，使乙醇濃度為75%，隨后的棉籽糖提取工藝同上。

1.2.2 種子培養(yǎng)

植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌種子培養(yǎng):將甘油保存的菌株活化后，接種于MRS液體種子培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)，溫度30℃，培養(yǎng)時間24 h。

釀酒酵母種子培養(yǎng):將甘油保存的菌株活化后，接種于YPD液體種子培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)，溫度30℃，培養(yǎng)時間48 h。

1.2.3 棉籽粕的固態(tài)發(fā)酵

取發(fā)酵底物20 g平鋪于250 mL三角瓶，接種植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和釀酒酵母，總接種量5%(v/w)，接種比例 4∶3∶3，30 ℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng) 48 h，中間翻料2次。發(fā)酵結(jié)束后的原料60℃烘干至恒重，再利用粉碎機將其粉碎并過60目篩，待測。

1.2.4 棉籽糖的純化

取一定量棉籽糖粗提液置于圓底燒瓶中，加入適量水進行減壓蒸餾，蒸出乙醇。蒸餾后的糖溶液用過量的質(zhì)量分數(shù)25%的醋酸鉛溶液沉淀蛋白，離心沉淀，重復(fù)3次至蛋白除盡，再用草酸除鉛至無鉛為止，定容到100 mL，分別測定定容后的棉籽糖濃度和棉酚含量。

取50 mL經(jīng)上述純化后的棉籽糖液于圓底燒瓶中，調(diào)pH至3.0，加入欲脫色棉籽粕質(zhì)量5%的活性炭，恒溫(50℃)進行棉籽糖液的脫色處理30 min。反應(yīng)完后用濾紙過濾，得到棉籽糖脫色液，分別測定原料液和脫色液的棉籽糖濃度和棉酚含量［8］。

1.3 分析方法

1.3.1 棉籽糖浸出率的測定

以HPLC法測定溶液中棉籽糖的濃度［9］。儀器型號為Waters 2487，色譜柱為Thermo C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測器為紫外檢測器(waters-2487);流動相為蒸餾水，流速1.0 mL/min;柱溫30℃，進樣量10 μL。棉籽糖浸出率:

η =V×C/(m ×θ)×100

式中:θ為棉籽粕中棉籽糖的百分含量;C為測定溶液中棉籽糖的濃度;V為合并得到提取液總體積;m為棉籽粕質(zhì)量。

1.3.2 游離棉酚、總棉酚含量的測定及脫毒率計算

參照GB/T8314-2013［10］來測定游離棉酚和總棉酚含量。棉籽粕的脫毒率:

脫毒率 /%=(m1－m2)/m1×100

式中:m1為發(fā)酵前游離棉酚含量;m2為發(fā)酵后游離棉酚含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種棉籽粕加工方式的比較(表1)

對植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和釀酒酵母單菌株及菌株組合發(fā)酵進行了研究(數(shù)據(jù)未顯示)，結(jié)果得到復(fù)合發(fā)酵效果要優(yōu)于單菌發(fā)酵，3菌株復(fù)合發(fā)酵效果最優(yōu)，其優(yōu)勢在于多菌株之間可相互補償其缺陷，發(fā)揮了協(xié)同互生作用。植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵棉籽粕脫毒能力強，釀酒酵母發(fā)酵棉籽粕主要增加蛋白含量。張文舉等［11］采用熱帶假絲酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8復(fù)合發(fā)酵棉粕，結(jié)果顯示復(fù)合發(fā)酵棉籽粕的綜合發(fā)酵效果優(yōu)于單菌株發(fā)酵，與本文研究結(jié)果一致，菌株復(fù)合發(fā)酵效果優(yōu)于單菌發(fā)酵。

表1 不同棉籽粕加工方式的比較Table 1 Comparison of different processing methods with cottonseed meal

棉籽粕經(jīng)過75%的乙醇浸提，不僅提取了大部分的棉籽糖，也帶走了一部分的棉酚、顆粒物和少量水溶性棉籽蛋白等雜質(zhì)。所以經(jīng)過方式二和方式三的提取操作，不僅棉籽粕中的游離棉酚含量遠低于方式一混菌發(fā)酵的結(jié)果，而且還能得到高附加值產(chǎn)物棉籽糖。方式二的棉酚脫毒率略低于方式三，但是棉籽糖浸出率和純度遠遠高于方式三。可能原因是方式三中棉籽粕經(jīng)過發(fā)酵，蛋白質(zhì)和小肽等物質(zhì)含量增加，提取過程雜質(zhì)增加，故而棉籽糖的浸出率和純度相對降低。綜合考慮棉籽糖浸出率和棉酚脫毒率兩項指標(biāo)，確定方式二―先浸提后發(fā)酵聯(lián)合工藝為最優(yōu)的棉籽粕加工方式。

2.2 先浸提后發(fā)酵工藝中棉籽糖浸提條件的影響

2.2.1 酶預(yù)處理的影響

使用75%的乙醇溶液提取棉籽粕，雖然選擇性好、滲透性強，但是能量消耗高;而輔以合適的酶處理，可分解棉籽粕結(jié)構(gòu)，加速有效成分釋放，提高棉籽糖浸出率。

比較了酶處理對棉籽糖浸提及發(fā)酵結(jié)果的影響，其中兩種工藝分別輔以添加植物水解酶和木瓜蛋白酶，結(jié)果如表2。工藝二在浸提前加入植物水解酶進行預(yù)處理，可以提高棉籽糖浸出率，是單純乙醇提取的104%，但大大降低了棉酚脫毒率，可能是植物水解酶的處理破壞了結(jié)合棉酚所致。植物水解酶含有較強的果膠裂解酶、碳水化合物酶和纖維素酶等，可加速糖分釋放，從而可提高棉籽糖提取率。這一結(jié)果與溫輝梁等研究結(jié)果一致［12］，果膠酶和纖維素酶分別是乙醇法提取的117%和139%。工藝三加入木瓜蛋白酶進行預(yù)處理反而顯著降低了棉籽糖浸出率，推測可能是大量蛋白質(zhì)和小肽的析出影響了棉籽糖的溶解。綜合考慮棉籽糖浸出率和棉酚脫毒率兩項指標(biāo)，確定聯(lián)合工藝中不進行酶的預(yù)處理。

表2 酶的預(yù)處理對棉籽糖浸提及發(fā)酵結(jié)果的影響Table 2 Effect of enzymatic pretreatment on raffinose extraction and fermentation results

2.2.2 含酸溶劑處理的影響

有文獻報道使用酸水解棉酚席夫堿，為了提取棉籽粕中的棉酚，使用了溶劑、水和酸［12］。因此研究了含不同酸的乙醇溶液浸提棉籽粕，濾渣烘干后固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果見表3。含1.4 mol/L檸檬酸的75%乙醇溶液浸提棉籽粕，棉籽糖浸出率最高(96.4%)，高于不含酸的75%乙醇溶液浸提水平;使用含鹽酸的乙醇溶液，其棉籽糖浸出率略低于不含酸的浸提水平。使用含1.4 mol/L磷酸的75%乙醇溶液提取棉籽粕，棉籽糖浸出率只有24.34%，但是脫毒率可達96.23%，和Pelitire等報道的研究結(jié)果一致［13］，使用磷酸的乙醇溶劑提取棉籽粕可以有效降低90%～95%棉酚含量。磷酸的存在能顯著提高棉酚的提取率，但是對棉籽糖的浸提效果非常差。綜合考慮，確定含1.4 mol/L檸檬酸的75%乙醇溶液為最優(yōu)浸提劑。

表3 含酸溶劑對棉籽糖浸提及發(fā)酵結(jié)果的影響Table 3 Effect of solvents containing different acid on raffinose extraction and fermentation results

2.3 浸提發(fā)酵工藝固態(tài)發(fā)酵階段棉酚含量的變化

提取棉籽糖過后的棉籽粕固態(tài)發(fā)酵，植物乳桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌和釀酒酵母的生長曲線見圖1。植物乳桿菌和發(fā)酵乳酸桿菌在0～8 h菌株生長較為平緩，8～24 h快速生長，為菌株的對數(shù)生長期，24～44 h處于平穩(wěn)期，幾乎無變化，44 h后活細胞量有下降趨勢。從圖1可知釀酒酵母的生長較乳酸菌遲緩，在0～18 h生長較慢，18～48 h活菌數(shù)增長快速。棉籽粕發(fā)酵48 h結(jié)束時，乳酸菌總數(shù)可達到6×109CFU/g。

圖1 植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵棉籽粕的生長曲線Fig.1 Growth curve of L.plantarum，L.fermenti and S.cerevisiae

提取棉籽糖過后的棉籽粕固態(tài)發(fā)酵，游離棉酚與總棉酚含量隨時間變化的曲線如圖2。游離棉酚和總棉酚隨發(fā)酵時間的增加總體都呈下降的趨勢，其中游離棉酚在發(fā)酵30 h后減少速率趨緩，對照圖1，表明菌體生長速率可能和游離棉酚減少速率相關(guān)。游離棉酚的減少總量510 mg/kg小于總棉酚減少量1 549 mg/kg，推測在微生物固態(tài)發(fā)酵過程中，部分結(jié)合狀態(tài)棉酚也被降解。

2.4 棉籽糖的純化

含1.4 mol/L檸檬酸的75%乙醇溶液浸提棉籽粕得到的提取液棉籽糖純度僅為33%，含有棉酚、棉籽蛋白、色素等大量雜質(zhì)，因此需要進一步純化，結(jié)果如表4所示。首先減壓蒸餾蒸出乙醇，棉酚難溶于水，故而大部分棉酚在水相中析出。再經(jīng)過除雜蛋白處理，得到顏色較淺、純度提高、總棉酚含量約0.011 mg/mL的棉籽糖水溶液;最后通過活性炭脫色處理，棉籽糖純度達到91.3%，且已檢測不到棉酚。

圖2 固態(tài)發(fā)酵中游離棉酚與總棉酚含量的時間變化過程Fig.2 Time course of content of free gossypol and total gossypol during solid-state fermentation

表4 棉籽糖純化結(jié)果Table 4 Results of raffinose purification

3 結(jié)論

通過單純的微生物固態(tài)發(fā)酵，游離棉酚含量由初始的1 274.7 mg/kg降低至158 mg/kg(表1)。通過本研究中棉籽粕浸提及固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合工藝，不僅進一步把棉籽粕中的游離棉酚含量從158 mg/kg降至118 mg/kg，而且可以得到96.4%浸出率的功能低聚糖棉籽糖。采用含1.4 mol/L檸檬酸的75%乙醇溶液提取棉籽粕中的棉籽糖，相比于75%乙醇溶液提取，棉籽糖浸出率從90.7%提高到96.4%，增加了6.3%。在48 h的固態(tài)發(fā)酵過程中，游離棉酚和總棉酚含量均隨發(fā)酵時間的增加而下降。

本研究首次將棉籽糖提取與固態(tài)發(fā)酵脫毒建立關(guān)聯(lián)，一方面從棉籽粕中提取得到了棉籽糖，另一方面，所得的發(fā)酵棉籽粕脫毒率高、棉籽糖含量低，提高了棉籽粕作為大宗蛋白飼料的飼用品質(zhì)。

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