馬玥，唐柯，徐巖，李記明，，于英，李蘭曉

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?，山東煙臺(tái)，264000)

冰葡萄酒(icewine)又被稱作冰酒，是以自然結(jié)冰的葡萄為原料，采用特殊釀造工藝釀成的一種甜型葡萄酒［1-2］，酸甜平衡，香氣濃郁，呈現(xiàn)出蜂蜜、桃子、焦糖、杏等香氣特征［3-4］，其獨(dú)特的風(fēng)味受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。

葡萄酒的風(fēng)味在很大程度上取決于葡萄酒中的香氣成分，葡萄酒香氣也是葡萄酒品質(zhì)中重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前對(duì)冰酒的香氣研究主要集中在對(duì)不同國(guó)家、地域及不同葡萄品種的感官評(píng)價(jià)及揮發(fā)性成分的檢測(cè)上。加拿大及德國(guó)是主要的冰酒生產(chǎn)國(guó)，其中加拿大冰酒具有水果及花香味，而德國(guó)冰酒則具有明顯的堅(jiān)果香［4-5］。在冰葡萄酒中已檢測(cè)到360余種揮發(fā)性成分，其中主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、萜烯類、硫化物、呋喃類、內(nèi)酯類及芳香族化合物［6］。每一類甚至每一種化合物對(duì)于葡萄酒香氣貢獻(xiàn)都不相同，在這些化合物中，目前僅發(fā)現(xiàn)幾十種化合物對(duì)冰酒香氣有重要貢獻(xiàn)，其在不同的冰酒中也具有不同的表現(xiàn)［3］。目前我國(guó)冰酒的香氣研究則主要集中在揮發(fā)性化合物檢測(cè)上。王玉峰等采用溶劑萃取法在赤霞珠冰葡萄酒中獲得了38種揮發(fā)性成分，其中，乙酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯、3-甲基丁醇、苯乙醇、2，3-丁二醇等含量較高［7］。李艷霞等采用固相微萃取技術(shù)，在威代爾冰酒中定性到59種揮發(fā)性成分［1］。王蓓等采用攪拌棒吸附萃取了威代爾冰酒中的揮發(fā)性成分，定性得到108種揮發(fā)性化合物［8］。

由于不同化合物的閾值不同，高含量的化合物其感官貢獻(xiàn)并不一定高，有些低閾值化合物在儀器上也無(wú)法檢測(cè)到。采用氣相色譜-聞香法(GC-O)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)分析樣品中風(fēng)味化合物可以用于尋找對(duì)樣品香氣貢獻(xiàn)較高的化合物。GC-O分析中常用到時(shí)間強(qiáng)度法、稀釋分析法與頻次法，又以稀釋分析法中的AEDA(aroma extraction dilution analysis)最為常見(jiàn)［9］。遼寧桓仁是中國(guó)重要的冰酒產(chǎn)區(qū)，所生產(chǎn)的威代爾冰酒具有怡人的香氣，但是其重要香氣成分仍不明確，因此探究形成冰酒感官特性的主要化合物并找出它們對(duì)于酒感官特性的貢獻(xiàn)對(duì)于冰酒的品質(zhì)控制有重要意義。本研究以同一年份不同等級(jí)的威代爾冰酒為研究對(duì)象，采用固相萃取法(SPE)對(duì)香氣進(jìn)行富集，在極性與非極性柱上通過(guò)GC-O結(jié)合GC-MS分析，來(lái)確定威代爾冰酒中重要的香氣成分，為指導(dǎo)冰酒的釀造及品質(zhì)控制提供理論依據(jù)及支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2010年產(chǎn)威代爾冰葡萄酒(煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?，包括黑鉆、藍(lán)鉆、黃鉆3個(gè)不同等級(jí)。甲醇(上海安譜，色譜純)，乙醇(上海安譜，色譜純)，二氯甲烷(上海安譜，色譜純)，Na2SO4(上海國(guó)藥集團(tuán)，分析純)，NaCl(上海國(guó)藥集團(tuán)，分析純)，C5-C30烷烴標(biāo)樣(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

Gerstel ODP2聞香裝置，德國(guó) Gerstel公司;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GC 6890N-MSD 5975，美國(guó)Agilent公司;萃取固相小柱為L(zhǎng)iChrolut EN(0.5 g填料)，Merck公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固相萃取方法

固相萃取柱潤(rùn)洗活化后，以1 mL/min的速率上樣，樣品體積為60 mL。樣品吸附結(jié)束后，用20 mL超純水洗去柱子上可能殘存的糖、色素等小分子極性化合物，用10 mL二氯甲烷洗脫柱上吸附的香氣化合物。用氮?dú)鈱⑤腿∮袡C(jī)相濃縮至250 μL，進(jìn)行GC-O及GC-MS分析。

1.3.2 分析條件

GC-O分析:AEDA法。冰酒香氣萃取樣品用二氯甲烷按1∶2比例等比稀釋，通過(guò)GC-O在色譜柱上分析樣品，直到無(wú)法嗅辨到香氣化合物。每種物質(zhì)的稀釋因子值為無(wú)法感知到該種香氣的最高稀釋度。每種樣品由2名經(jīng)過(guò)半年以上聞香培訓(xùn)的聞香員進(jìn)行嗅辨分析，每個(gè)樣品的每個(gè)稀釋度進(jìn)樣3次。3次中出現(xiàn)2次以上則保留該稀釋因子數(shù)值。香氣化合物通過(guò)使用DB-FFAP及HP-5MS兩種色譜柱來(lái)定性。

極性色譜柱為DB-FFAP(60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司)。柱溫采用程序升溫，初溫50℃保持2 min，以6℃/min速率升溫至230℃并保持15 min;進(jìn)樣口溫度為250℃;不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量 1μL;載氣為氦氣，流速 2mL/min。［0］

非極性色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm，美國(guó) Agilent公司)。柱溫采用程序升溫，初溫50℃保持2 min，以5℃/min速率升溫至240℃并保持15 min;進(jìn)樣口溫度為250℃;不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量 1μL;載氣為氦氣，流速 2mL/min。［0］

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度230℃;質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.3 定性方法

香氣活性成分的定性通過(guò)與NIST 05質(zhì)譜庫(kù)(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖匹配、與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)比對(duì)、香氣化合物香氣特征及標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)確定。保留指數(shù)根據(jù)改進(jìn)的Kovats法計(jì)算得到，在待測(cè)酒樣中加入C5-C30烷烴的混標(biāo)，進(jìn)GC-MS分離，通過(guò)烷烴的保留時(shí)間來(lái)計(jì)算未知化合物的RI。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-O嗅辨分析及GC-MS定性分析結(jié)果

利用SPE將不同等級(jí)的3種冰酒進(jìn)行香氣濃縮，通過(guò)GC-O嗅辨分析及GC-MS定性分析共獲得65種對(duì)冰酒香氣有一定貢獻(xiàn)的化合物，結(jié)果如表1所示。3種同年份冰酒的極性柱總離子流色譜圖如圖1～圖3所示。其中檢測(cè)到酯類13種、醇類13種、萜烯類11種、芳香族化合物4種、酚類4種、內(nèi)酯3種、酸類3種、硫化物3種、呋喃酮2種、醛酮類1種及未知化合物8種。

圖1 黑鉆級(jí)冰酒揮發(fā)性成分極性柱GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Black)separated by polar column

圖2 藍(lán)鉆級(jí)冰酒揮發(fā)性成分極性柱GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Blue)separated by polar column

圖3 黃鉆級(jí)冰酒揮發(fā)性成分極性柱GC-MS總離子流色譜圖Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Yellow)separated by polar column

由表1可以發(fā)現(xiàn)，同一年份3種等級(jí)的威代爾冰酒在聞香獲得的香氣化合物的種類上有一定差別，但最重要的香氣化合物(至少在一種酒中，其稀釋因子在81以上)基本相同，只是在其香氣強(qiáng)度上有一定差異，說(shuō)明不同等級(jí)冰酒主要香氣成分構(gòu)成上具有一致性，同時(shí)釀造工藝又對(duì)冰酒的香氣輪廓產(chǎn)生一定影響，也構(gòu)成了不同等級(jí)冰酒所特有的香氣特征。這些重要的香氣化合物主要為酯類、醇類、萜烯類、硫化物及呋喃酮類化合物，包括異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、異戊醇、2-庚醇、1-庚醇、順式-玫瑰醚、3-甲硫基丙醛、脫氫芳樟醇、β-大馬酮、菠蘿酮及3種未知香氣化合物。

表1 威代爾冰酒香氣化合物AEDA聞香結(jié)果Table 1 Important aroma compounds in Vidal icewine detected by GC-O/MS

2.2 不同活性香氣化合物分析

2.2.1 酯類

酯類化合物是發(fā)酵類飲品中重要的香氣化合物，由醇及酸通過(guò)酯化反應(yīng)產(chǎn)生。在葡萄酒中，酯類化合物可分為通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的及在低pH環(huán)境下貯藏過(guò)程產(chǎn)生的兩類［10］。

續(xù)表1

3種不同等級(jí)的冰酒中共聞到13種酯類化合物，其主要表現(xiàn)為水果香。其中乙酸乙酯(蘋(píng)果)、異丁酸乙酯(菠蘿)、丁酸乙酯(甜瓜)、己酸乙酯(果皮)及辛酸乙酯(荔枝)在3種酒中稀釋因子不低于9。其中異丁酸乙酯在黑鉆級(jí)冰酒中稀釋因子可達(dá)243。這幾種酯類除了己酸乙酯外，其他幾種在Bowen等人對(duì)加拿大威代爾冰酒的重要香氣研究中沒(méi)有聞到［3］，這可能是由于地域性差異造成的。2-甲基丁酸乙酯，在三等級(jí)酒中皆有檢測(cè)到，但是在黃鉆級(jí)酒中香氣強(qiáng)度較弱，稀釋因子僅為1，而在黑鉆級(jí)酒中稀釋因子為243，該化合物有蘋(píng)果類香氣。

2.2.2 醇類

醇類化合物是酒中重要的風(fēng)味化合物，醇類化合物是酒精發(fā)酵、氨基酸轉(zhuǎn)化及亞麻酸降解物氧化的主要產(chǎn)物。3種不同等級(jí)的冰酒中共聞到13種醇類化合物，其主要表現(xiàn)為植物清香。其中異戊醇、己醇、2-庚醇及1-庚醇對(duì)冰酒的香氣貢獻(xiàn)較為明顯，其稀釋因子不低于9，特別是異戊醇，在醇類化合物中對(duì)冰酒的香氣貢獻(xiàn)最大，其稀釋因子在3種酒中皆高于243，表現(xiàn)為類似指甲油一樣的清香。異戊醇在葡萄酒中的含量很高，其在冰酒中含量超過(guò)10 mg/L［5］。己醇表現(xiàn)為松子或堅(jiān)果味，2-庚醇表現(xiàn)為蘑菇味，1-庚醇具有一種類似烘烤或油脂的味。

2.2.3 萜烯類

萜烯類化合物是葡萄酒中微量成分，具有較低的閾值，對(duì)葡萄酒的香氣貢獻(xiàn)較大。萜烯化合物的種類及含量與葡萄品種，土壤，氣候及葡萄栽培有很大關(guān)系［11］。

3種不同等級(jí)的冰酒中共聞到11種萜烯類化合物。在11種萜烯類化合物中，對(duì)香氣貢獻(xiàn)最大的是順式-玫瑰醚、β-大馬酮及脫氫芳樟醇，這3種香氣在3種酒中的稀釋因子皆高于27。順式-玫瑰醚表現(xiàn)為荔枝或玫瑰香，在黃鉆級(jí)的酒中稀釋因子最高，為81。β-大馬酮是威代爾冰酒中重要的香氣化合物，具有近似蜂蜜的甜香味，在3種級(jí)別的酒中稀釋因子皆不低于243，在黑鉆及藍(lán)鉆級(jí)別的酒中，其稀釋因子可達(dá)729。β-大馬酮在食品及葡萄酒香氣成分分析中已被廣泛報(bào)道，其具有極低的覺(jué)察閾值，僅為0.05 μg/L。順式-玫瑰醚及β-大馬酮皆具有怡人的甜香，在Bowen等人對(duì)加拿大威代爾冰酒的研究中同樣也發(fā)現(xiàn)其是重要的香氣化合物［3］。

2.2.4 硫化物

3個(gè)等級(jí)的威代爾葡萄酒中共聞到3種硫化合物，無(wú)法通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)到，是由極性與非極性的保留指數(shù)定性及獨(dú)特的香氣特征匹配得到的，推測(cè)其為4-巰基-4-甲基-2-戊酮、2-甲基-3-呋喃硫醇及 3-甲硫基丙醛。其中貢獻(xiàn)最大的是3-甲硫基丙醛，表現(xiàn)為煮土豆味，在3種酒中的稀釋因子皆為81。4-巰基-4-甲基-2-戊酮的香氣特征是典型的黑醋栗芽孢味，2-甲基-3-呋喃硫醇則表現(xiàn)出一種堅(jiān)果的香氣特征。

2.2.5 呋喃及內(nèi)酯類

呋喃是食品中重要的風(fēng)味化合物，在葡萄酒香氣的研究中，呋喃類化合物也被廣泛地報(bào)道，呋喃類化合物在食品中的形成途徑可分為3種，包括碳水化合物的熱解，美拉德反應(yīng)及焦糖化反應(yīng)［12］。內(nèi)酯類化合物一般由對(duì)應(yīng)的羥基酸在一定的條件下環(huán)化而成，4-烷基丁內(nèi)酯(γ-lactones)及 5-烷基戊內(nèi)酯(δ-lactones)是酒中常見(jiàn)的內(nèi)酯類化合物，對(duì)香氣有積極貢獻(xiàn)［13］。

菠蘿酮(furaneol)，醬油酮(homofuraneol)是葡萄酒中2種重要的呋喃酮類香氣化合物，在紅葡萄酒、白葡萄酒及貴腐酒中皆有檢出，在貴腐酒中最高稀釋因子分別可達(dá)625及3 125［14-16］。在本研究中，菠蘿酮和醬油酮其香氣表現(xiàn)為焦糖類的甜香，菠蘿酮的稀釋因子最高為243，醬油酮的稀釋因子最高為27。美拉德反應(yīng)是一種還原糖與氨基酸在一定的水分條件下發(fā)生的羰氨反應(yīng)。在冰酒體系中，其糖含量很高，并且主要以還原糖為主，而總氨基酸含量也在1g/L以上［17］。因此，美拉德反應(yīng)可能是造成冰酒中這兩種呋喃酮類化合物高香氣強(qiáng)度的原因。

研究?jī)H通過(guò)MS定性獲得了3種內(nèi)酯化合物，分別是γ-癸內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯及桃醛，桃醛也稱丙位十一內(nèi)酯。這3種內(nèi)酯的香氣特征比較相似，皆表現(xiàn)為桃子或杏干。這3種內(nèi)酯化合物在3種酒中，除了桃醛在藍(lán)鉆級(jí)的酒中的稀釋因子為27，其稀釋因子皆不高于9，但是這3種內(nèi)酯可能是冰酒中杏桃味的重要來(lái)源。

2.2.6 其他類

除了酯類、醇類、萜烯類、硫化物、呋喃酮類及內(nèi)酯類化合物，威代爾冰酒中還有芳香類、酚類、酸類及醛酮類化合物，也對(duì)其香氣存在一定貢獻(xiàn)。

威代爾冰酒中重要的芳香族化合物有苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、苯乙醇，其分別表現(xiàn)蘋(píng)果、花香、汽油及花香。曾有研究認(rèn)為苯乙醇是威代爾冰酒的特征香氣［2］，但是從本結(jié)果來(lái)看，其稀釋因子不高于27，對(duì)冰酒的香氣貢獻(xiàn)并不顯著。

在3種不同等級(jí)的冰酒中還聞到4種酚類化合物。酚類化合物大多由橡木帶來(lái)，如橡木桶，橡木片甚至橡木塞。本研究中對(duì)冰酒香氣有一定貢獻(xiàn)的有愈創(chuàng)木酚及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，其表現(xiàn)為煙熏煙草類的刺激味，其在三等級(jí)的冰酒中稀釋因子均不低于3。實(shí)驗(yàn)中僅聞到癸醛這一種醛酮類化合物對(duì)冰酒香氣存在貢獻(xiàn)，其表現(xiàn)為堅(jiān)果味。酸是酒中重要的組成部分，其在酒的揮發(fā)性化合物含量中也占有較高比例，但是由于酸的覺(jué)察閾值也較高，其對(duì)冰酒的香氣貢獻(xiàn)只起到輔助作用。本研究結(jié)果顯示對(duì)冰酒香氣有貢獻(xiàn)的酸包括乙酸、辛酸及癸酸，3種酸中只有辛酸在3個(gè)等級(jí)的冰酒中皆有聞到，這3種酸的稀釋因子皆不高于3。

此外在3種不同等級(jí)的冰酒中還聞到8種未知化合物，其中7.24 min出現(xiàn)的奶油味，8.72 min出現(xiàn)的藍(lán)莓味及25.29 min出現(xiàn)的蜂蜜味具有較高的稀釋因子，在冰酒中較為重要。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用SPE結(jié)合GC-O及GC-MS分析，通過(guò)化合物在極性柱與非極性柱上的聞香結(jié)果，保留指數(shù)計(jì)算及質(zhì)譜庫(kù)匹配來(lái)確定威代爾冰酒中的重要香氣化合物。實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到65種對(duì)冰酒香氣有一定貢獻(xiàn)的化合物，包括酯類13種、醇類13種、萜烯類11種、芳香族化合物4種、酚類4種、內(nèi)酯3種、酸類3種、硫化物3種、呋喃酮2種、醛酮類1種及未知化合物8種。其中酯類、醇類、萜烯類、硫化物、呋喃酮類及內(nèi)酯類是威代爾冰酒中重要的香氣物質(zhì)，主要表現(xiàn)為水果味，植物清香，花香，烘焙類香氣及甜香。在所有已知的香氣化合物中，異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、異戊醇、2-庚醇、1-庚醇、順式-玫瑰醚、3-甲硫基丙醛、脫氫芳樟醇、β-大馬酮及菠蘿酮對(duì)冰酒的香氣貢獻(xiàn)較大，其至少在一個(gè)級(jí)別的酒中最高稀釋因子不低于81。這幾種重要的香氣化合物在3個(gè)等級(jí)的冰酒中均能檢測(cè)到，但其香氣強(qiáng)度存在一定差異，表明釀造工藝可對(duì)冰酒的香氣輪廓產(chǎn)生一定影響。

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