鄒偉，趙長青，趙興秀，張靜

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢，643000)

泡菜主要以新鮮蔬菜為原料，添加或不添加輔料，在3% ～7%的食鹽水中，經(jīng)微生物自然發(fā)酵15～30 d，腌漬成菜［1］。泡菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，早在距今3千多年前的商朝就已經(jīng)是人們飲食文化的一部分［2］，其味道酸鮮純正，脆嫩芳香，清爽可口，同時(shí)還富含多種纖維素、氨基酸和微量元素，能促進(jìn)腸胃消化，提高人體免疫能力。近20年，我國泡菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2013年中國泡菜的產(chǎn)值已突破150億元，年均增長速度為20% ～30%。目前，泡菜的生產(chǎn)采用高鹽、浸泡等傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)環(huán)境差，規(guī)模偏小，工序復(fù)雜，勞動(dòng)強(qiáng)度大，受季節(jié)影響等限制，產(chǎn)品質(zhì)量極不穩(wěn)定，其國際知名度與韓國泡菜(kimchi)、日本泡菜相比較低。造成這些現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是泡菜的生產(chǎn)過程是依靠自然微生物發(fā)酵進(jìn)行，微生物群落在泡菜腌制過程中產(chǎn)生各種酶，以及自身生長過程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物等，為泡菜特殊風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生提供物質(zhì)基礎(chǔ)。這一過程耗時(shí)較長且容易受到自然環(huán)境中區(qū)域、溫度、濕度等因素的影響，因而不同批次產(chǎn)品的質(zhì)量會(huì)出現(xiàn)較大的差異，從而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。目前泡菜的生產(chǎn)工藝急需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化升級，強(qiáng)化生產(chǎn)工藝，穩(wěn)定產(chǎn)品的質(zhì)量。解決目前現(xiàn)狀的關(guān)鍵是弄清我國泡菜發(fā)酵過程對其特殊風(fēng)味物質(zhì)形成相關(guān)的微生物群落組成及其發(fā)酵機(jī)制。本文主要綜述了近幾年針對泡菜微生物群落發(fā)酵機(jī)制的研究進(jìn)展。

1 泡菜中微生物群落結(jié)構(gòu)

泡菜的發(fā)酵是一個(gè)開放式、厭氧的環(huán)境，初始微生物是鹽水浸沒時(shí)殘留于蔬菜上的微生物，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物群落的種類和數(shù)量不斷演替，最終使泡菜形成特有的風(fēng)味［3］。這其中對風(fēng)味起主要作用的是乳酸菌、酵母菌，同時(shí)還存在一些其他的微生物。

早期主要通過傳統(tǒng)的分離純化和形態(tài)生理特征鑒定來研究泡菜中的乳酸菌系。例如鐘之絢等在泡白菜的發(fā)酵前檢測植物乳桿菌，中期有植物乳桿菌、格氏乳桿菌、彎曲乳桿菌、德氏乳桿菌德氏亞種和乳糖亞種，后期有植物乳桿菌和棉子糖鏈球菌，共5種和2個(gè)亞種［4］。最近，Xiong Tao等發(fā)現(xiàn)泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌有 Enterococcus faecalis、Lactococcus lactis subsp.Lactis、Leuconostoc mesenteroides subsp.Mesenteroides、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei和Lactobacillus zeae［5］。細(xì)菌形態(tài)生理特征鑒定適用于屬的鑒別，而對種的確定不太明顯［6］?；诰N16S rRNA序列結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)生理特征方法可以更精確鑒定分離的菌種。盛海圓等利用此法鑒定了從傳統(tǒng)泡菜中篩得的46株菌，分布于乳桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬和片球菌屬4個(gè)屬的9個(gè)種，并發(fā)現(xiàn)存在 Lactobacillus namurensis和巴氏葡萄球菌［7］。上述方法局限于對可培養(yǎng)微生物的鑒定，但目前實(shí)驗(yàn)室能夠培養(yǎng)分離出的微生物占環(huán)境樣品的比例不到1%［8］，因此需要一系列“免培”的檢測方法(如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳相結(jié)合(PCRDGGE)、16S rRNA基因文庫等)用于研究泡菜發(fā)酵過程乳酸菌群落的組成、豐度及其變化情況。代道芳同時(shí)用生理形態(tài)鑒定和PCR–DGGE鑒定了泡菜中的乳酸菌系［9］，發(fā)現(xiàn)經(jīng)表型特征和系統(tǒng)的生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，泡菜中的乳酸菌為乳桿菌屬、鏈球菌屬、四聯(lián)球菌屬3個(gè)屬，植物乳桿菌、德氏乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸鏈球菌、鹽水四聯(lián)球菌5個(gè)種。經(jīng)DGGE鑒定出泡菜中含有的保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、漫游球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌有較近的親緣關(guān)系，相似性達(dá)到100%。類似的關(guān)于泡菜乳酸菌群落的研究詳見表1。

表1 國內(nèi)泡菜發(fā)酵微生物群落的相關(guān)研究Table 1 Research on the microbial community of Chinese sauerkraut fermentation

上述研究主要針對泡菜中乳酸菌的構(gòu)成，對乳酸菌在泡菜發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)演變卻研究較少(表1)。通常在泡菜發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)主要是酸耐受性低、微厭氧的乳酸菌如Leuconostoc屬的 Leu.mesenteroides、Leu.Citreum，隨著發(fā)酵的進(jìn)行乳酸積累，嚴(yán)格厭氧環(huán)境的形成、酸耐受性高、嚴(yán)格厭氧的乳酸菌如Lactobacillus、Weissella屬的 L.sakei、L.plantarum、W.koreensis漸占主導(dǎo)［18］。XIONG Tao等通過傳統(tǒng)方法證實(shí)泡菜發(fā)酵啟動(dòng)過程L.mesenteroides subsp.Mesenteroides占主導(dǎo)，然后逐步由 E.faecalis、L.lactis、L.zeae 替代，最終由L.plantarum和L.casei完成發(fā)酵［5］。目前，基于“免培”的方法探究中國泡菜中乳酸菌群落動(dòng)態(tài)變化的研究尚無，這也是未來研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。

除乳酸菌外，酵母菌在泡菜發(fā)酵中也起著重要作用。酵母菌能消耗可發(fā)酵糖，主要生成乙醇、少量甘油和一些特殊風(fēng)味的醇類物質(zhì)，可抑制有害菌如腐敗菌的生長，有利于泡菜后熟階段發(fā)生醋化反應(yīng)和芳香物質(zhì)的形成。張先琴等通過PCR-DGGE發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)家庭制作泡菜中真菌主要有熱帶假絲酵母、漢遜德巴利酵母、奧默柯達(dá)菌和一些不可培養(yǎng)的真菌等［12］。曾俊等從自制四川泡菜中分離鑒定2種酵母:單孢釀酒酵母、膜璞畢赤酵母，它們均存在于泡菜發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵進(jìn)行數(shù)量持續(xù)減少，5 d后消失［16］。此外，酵母菌 P.manshurica、P.kudriavzevii、C.tropicalis等經(jīng)鑒定大量繁殖會(huì)使腌漬品的表面生花，產(chǎn)生不愉快的酸臭味，最終導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)［19］，必須引起重視。

在泡菜發(fā)酵過程中，除乳酸菌、酵母之外還存在其他微生物。張宗舟等發(fā)現(xiàn)泡菜中微生物菌系還包括醋酸菌和丁酸菌［15］。Yang Hongyan等通過基因文庫鑒定發(fā)現(xiàn)泡菜中存在 Acinetobacter sp.、Pseudomonas fragi、Klebsiella sp.、Citrobacter sp.、Betaproteobacteria sp.等細(xì)菌［17］。田偉等發(fā)現(xiàn)泡菜中不可培養(yǎng)細(xì)菌占總細(xì)菌數(shù)的32%，但不可培養(yǎng)微生物在泡菜中的作用還有待闡明［13］。另外，Lu等人證實(shí)泡菜中存在噬菌體可侵染乳酸菌［20］。最近，研究人員在韓國泡菜中發(fā)現(xiàn)噬菌體基因［21］，相關(guān)研究在國內(nèi)尚未見報(bào)道。

2 外界因素對泡菜微生物群落的影響

泡菜發(fā)酵是一個(gè)多種微生物共存的混合發(fā)酵體系，不同的發(fā)酵蔬菜品種，氣候、地域、過程加工的參數(shù)均能夠影響泡菜發(fā)酵過程的微生物群落，最終導(dǎo)致風(fēng)味、口感、營養(yǎng)的不同。通過操縱這些因素，使微生物群落朝著有利的方向演替，是改造泡菜生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵。泡菜中起主要作用的是乳酸菌系［22］，因此需要調(diào)控發(fā)酵條件，促進(jìn)乳酸菌的生長繁殖，并抑制有害微生物的生長。乳酸菌最適宜的溫度范圍是26～30℃［23］，在該溫度段，乳酸菌生長繁殖最快，產(chǎn)酸率最高。發(fā)酵初始時(shí)為抑制兼性厭氧細(xì)菌和酵母的生長，溫度不宜過高，待乳酸積累一定量后，可適當(dāng)提高溫度，發(fā)酵結(jié)束后應(yīng)將溫度降低，防止產(chǎn)酸過高。楊瑞等發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵溫度為26℃時(shí)，泡菜中微生物的生長速度遠(yuǎn)比18℃時(shí)快，但乳酸菌此時(shí)不能形成生長優(yōu)勢［24］。

泡菜生產(chǎn)過程需要加入一定量的食鹽，泡菜微生物群落成員對食鹽濃度的耐受性各不相同。通常乳酸菌能夠耐受8%的食鹽濃度［25］，發(fā)酵泡菜常用的食鹽濃度在3% ～6%［23，25］，濃度過低時(shí)乳酸菌雖然生長迅速，但對有害微生物的抑制不明顯，食鹽濃度應(yīng)控制在既能抑制有害微生物又不影響乳酸菌發(fā)酵活動(dòng)的范圍之內(nèi)。尹立端等發(fā)現(xiàn)10%的食鹽能延長異型乳酸菌的發(fā)酵時(shí)間，較顯著抑制真菌和腸道菌的生長，4%的食鹽能縮短異型乳酸菌的發(fā)酵時(shí)間，較大程度抑制腸道菌和芽孢菌的生長，7%的食鹽腌制的泡菜產(chǎn)品感官評定優(yōu)于前2種［26］。研究表明在較低溫度下發(fā)酵，6%的鹽濃度比8%的鹽濃度能更好地促進(jìn)乳酸菌的生長［24］。

pH是影響微生物生長的重要因子，在泡菜發(fā)酵過程中，隨著乳酸菌的繁殖，大量分泌乳酸，造成溶液中pH值的下降。但在腌制初期，需要控制發(fā)酵的初始pH，抑制其他的雜菌生長，乳酸菌一般能夠耐受的環(huán)境 pH 為1.5 ～.5［14，27］，若酸度低于此范圍，便不能生長。黃琴發(fā)現(xiàn)添加0.5%乳酸能有效地縮短發(fā)酵時(shí)間，抑制一部分腐敗微生物的生長，產(chǎn)品的色香味最好［28］。

發(fā)酵過程中乳酸菌是厭氧菌，而部分有害菌是好氧菌，隔絕空氣就可抑制這部分有害菌的活動(dòng)。真空度越高越有利于對泡菜中乳酸菌的增殖，對泡菜中的其他雜菌的抑制作用越明顯［29］。另外，泡菜生產(chǎn)中加入不同比例的天然物質(zhì)，可以增進(jìn)泡菜的風(fēng)味。添加花椒、大蒜、茴香、辣椒能明顯促進(jìn)乳酸菌生長［24，30］，添加花椒同時(shí)還能促進(jìn)酵母的生長［24］。孫力軍等進(jìn)一步證實(shí)大蒜、茴香、辣椒3種香辛料主要對明串珠菌和植物乳桿菌有促進(jìn)作用［30］。

在發(fā)酵初始添加乳酸菌活菌制劑，促使乳酸菌在發(fā)酵初始便處于優(yōu)勢地位，縮短發(fā)酵周期，也是常用的調(diào)控泡菜發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的手段。與自然發(fā)酵相比，直投乳酸菌劑發(fā)酵具有縮短發(fā)酵周期，降低發(fā)酵鹽用量，提高益生菌含量等優(yōu)點(diǎn)［31］。目前泡菜直投式菌劑有單獨(dú)用植物乳桿菌［32］、嗜酸乳桿菌［33］或者混合使用多種乳酸菌如:腸膜明串珠菌和植物乳桿菌［34］、戊糖片球菌和植物乳桿菌［35］、短乳桿菌和植物乳桿菌［36］。熊濤等發(fā)現(xiàn)相比于自然發(fā)酵，直投式發(fā)酵菌劑對泡菜微生物群落中病原菌(大腸菌群、沙門氏菌與金黃色葡萄球菌)的生長具有顯著抑制作用［32］。

3 宏基因組學(xué)技術(shù)在泡菜微生物群落中的應(yīng)用

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學(xué)(也稱元基因組學(xué)，metagenomics)在分析發(fā)酵過程微生物群落變化等方面展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢［37］。在元基因組學(xué)研究中，借助于大規(guī)模序列分析，在基因序列分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)分析工具和相關(guān)數(shù)據(jù)庫，能夠發(fā)現(xiàn)大量過去無法得到的未知微生物新基因或新的基因簇，這對了解微生物區(qū)系組成、進(jìn)化歷程和代謝特點(diǎn)，挖掘具有應(yīng)用潛力的新基因等都具有重要意義［38］。目前，宏基因組分析已用于發(fā)酵食品中的微生物群落研究方面，Jung等利用454GS FLX Titanium對Kimchi發(fā)酵過程中微生物群落宏基因組學(xué)測序，通過宏基因組序列分析研究了Kimchi發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)、代謝潛力、群落遺傳特征的變化［21］。但是宏基因組學(xué)分析通常僅集中于物種或基因?qū)用?，且這些信息是分散的、相互聯(lián)系較少的，難以得出明確的、全面的結(jié)論。而實(shí)際的微生物群落中各個(gè)成分是相互作用的，形成一個(gè)交錯(cuò)的網(wǎng)絡(luò)。整合這些宏基因組分析得到的物種和功能基因集合，構(gòu)建從宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)到微生物群落生理特性的聯(lián)系，并能分析和預(yù)測相應(yīng)的生理功能特點(diǎn)［39］，也是后續(xù)工作的熱點(diǎn)。隨著宏基因組學(xué)技術(shù)以及系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建微生物群落水平的代謝網(wǎng)絡(luò)模型顯得至關(guān)重要，也成為一種趨勢［39］。目前，該類系統(tǒng)代謝模型已成功用在分析種間共生、競爭、寄生與進(jìn)化等相互關(guān)系［40］。系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)研究泡菜發(fā)酵過程微生物群落機(jī)制的基本路線即通過宏基因組測序，認(rèn)識(shí)泡菜發(fā)酵過程的關(guān)鍵微生物以及關(guān)鍵功能基因，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建泡菜發(fā)酵過程微生物群落規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，借助于系統(tǒng)生物學(xué)分析方法，解析泡菜發(fā)酵過程不同階段的代謝特性，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)等，從而揭示泡菜發(fā)酵過程的相關(guān)機(jī)制。系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，將為泡菜的生產(chǎn)工藝現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化改進(jìn)提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他傳統(tǒng)醬腌菜研究提供參考。

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