崔磊， 金英今， 尹成日,*

( 1.延邊大學(xué)理學(xué)院 化學(xué)系； 2.延邊大學(xué)分析測試中心: 吉林 延吉 133002 )

黨參內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化人參根總皂苷為稀有人參皂苷F2和C-K的研究

崔磊1， 金英今2， 尹成日1,2*

( 1.延邊大學(xué)理學(xué)院 化學(xué)系； 2.延邊大學(xué)分析測試中心: 吉林 延吉 133002 )

利用組織分離法從黨參中分離得到32種內(nèi)生菌，其中菌株D19轉(zhuǎn)化人參主皂苷為稀有皂苷的活性最強.在最佳發(fā)酵條件(水培養(yǎng)基，pH 5.0)下，稀有人參皂苷F2、C-K和Rh1的最高產(chǎn)率分別為30%、17%和8%.根據(jù)單體皂苷轉(zhuǎn)化實驗確定了稀有人參皂苷的來源和人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化路徑，并通過16S rDNA序列分析，鑒定內(nèi)生菌D19為藤黃色桿菌屬(Dyella).

黨參； 稀有人參皂苷； 內(nèi)生菌； 生物轉(zhuǎn)化

人參(PanaxginsengC.A.Mey)為五加科人參屬植物的根，其成分有人參皂苷、多糖、黃酮類化合物、揮發(fā)性油等[1]，其中人參皂苷為人參屬植物的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗衰老、軟化血管、保肝等作用[2-3].研究表明[4]，由于稀有人參皂苷(Rh1、Rh2、F2、C-K等)具有尺寸小、生物利用度高、細胞膜滲透性強等特點，因此比人參主皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1等)具有更好的藥理活性.然而，稀有人參皂苷在天然人參屬植物中的含量極少，因此將人參主皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的研究具有重要的意義[5].近些年，以人參主皂苷為原料進行生物轉(zhuǎn)化的研究取得了許多有意義的成果[6-8]，其方法主要有化學(xué)法(酸水解、堿水解、Smith降解)和生物法(酶或微生物)，其中生物轉(zhuǎn)化法具有特異性高、成本低、反應(yīng)條件溫和、選擇性高、環(huán)境友好的優(yōu)點[9-10]，被認為是獲取稀有人參皂苷的最有效的方法.

植物內(nèi)生菌(endophytes)是指存活于健康植物組織內(nèi)部，而又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群，主要包括真菌、細菌和放線菌[11].近年來，內(nèi)生菌在生物轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用已引起了人們的廣泛關(guān)注，并已經(jīng)應(yīng)用于一些天然化合物的生物合成，如黃烷、四氫呋喃木酚素和黃芪皂苷[12-14].本文首次從含有三萜類成分的黨參中分離得到具有人參皂苷生物轉(zhuǎn)化活性的內(nèi)生菌，并探討了其轉(zhuǎn)化率及轉(zhuǎn)化路徑.

1 材料與方法

1.1 試劑

人參皂苷從成都思科華生物技術(shù)有限公司購買，黨參從延吉市參茸市場購買，薄層層析板Silica gel 60-F254從德國Merck公司購買，R2A瓊脂培養(yǎng)基從Sigma公司購買.化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 儀器

實驗儀器有：立式電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KB，上海申安醫(yī)療器械)；生物安全柜(BSC-1300ⅡA/B3)； pH計(雷磁PHS-3C型)； PCR儀(TC-512，英國Techne公司)；光學(xué)顯微鏡(BX61， 上海比目儀器公司)；電子天平(JA5003型，上海良平儀器儀表有限公司)；高速離心機(MCD-2000 HSIANGTAI)；液相色譜儀(LC-6A，日本島津)；振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-C，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國Agilent公司).

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：去皮馬鈴薯200～300 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，去離子水1 L.將去皮馬鈴薯切成小塊，加1 L水煮沸，沸騰30 min后，用紗布過濾，補足1 L水，加入葡萄糖和瓊脂粉，攪拌溶解后，分裝滅菌.

液體培養(yǎng)基(LL培養(yǎng)基)：NH4Cl 0.5 g，K2HPO41.0 g， KH2PO40.5 g， MgSO40.25 g， 酵母粉1.0 g， 蒸餾水1 L， pH 7.0.

1.4 黨參內(nèi)生菌的分離篩選

參照Surette等[15]描述的方法，將新鮮無損的黨參在48 h內(nèi)進行內(nèi)生菌分離.消毒前，將黨參在流動的自來水下充分沖洗，然后按以下順序進行表面消毒： 70%(體積分數(shù))乙醇1 min， 5%(體積分數(shù))次氯酸鈉5～10 min， 70%(體積分數(shù))乙醇1 min，無菌水1 min，洗滌4次.消毒后的樣本用干燥無菌濾紙擦干，然后用無菌手術(shù)刀去除外部組織，切成0.5 cm×0.5 cm小段，按壓在PDA瓊脂平板、R2A瓊脂平板和LB瓊脂平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d.

在培養(yǎng)期間，基于菌落的形態(tài)學(xué)特征和外貌形態(tài)，分離不同菌落，經(jīng)反復(fù)多次得到單一菌株.利用七葉苷顯色原理[8]，把單一菌株涂在由七葉苷(Esuclin)修飾的R2A瓊脂(E-R2A)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基的顏色變化(變黑)，篩選出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株.七葉苷修飾的R2A瓊脂培養(yǎng)基成分為： R2A瓊脂15.2 g，七葉苷1.0 g，檸檬酸鐵0.5 g.

1.5 人參根總皂苷的微生物轉(zhuǎn)化

在1.5 mL離心管內(nèi)加入270 μL無菌液體培養(yǎng)基和30 μL 20 mg/mL的人參根總皂苷，然后接種300 μL產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株培養(yǎng)液；培養(yǎng)7 d后，加入600 μL飽和正丁醇液終止反應(yīng)，高速離心后取上清液進行TLC和HPLC分析，篩選出具有人參皂苷生物轉(zhuǎn)化活性的菌株.

1.6 人參根總皂苷發(fā)酵條件的優(yōu)化

為了得到較高產(chǎn)量的稀有人參皂苷，對生物轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化.選取6種不同的培養(yǎng)基：水、R2A、PDB、LB、NB、LL， pH值7.0，以20 mg/mL的人參根總皂苷為底物，30 ℃空氣振蕩浴中培養(yǎng)7 d后，加入等體積飽和正丁醇終止反應(yīng)，離心后用于TLC分析，以此確定活性菌株的最適培養(yǎng)基.在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，對生物轉(zhuǎn)化的pH條件進行優(yōu)化，起始pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0， 后續(xù)處理同上.

在最適培養(yǎng)基和pH值條件下，利用高效菌株D19對人參根總皂苷進行微生物轉(zhuǎn)化，并用HPLC分析人參皂苷含量的變化.

1.7 內(nèi)生菌D19對單體皂苷的生物轉(zhuǎn)化

分別以滅菌后的1 mg/mL單體人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd和Rg1為底物，于內(nèi)生菌D19的菌懸液中進行微生物轉(zhuǎn)化實驗；在30 ℃，160 r/min空氣浴恒溫振蕩器中發(fā)酵7 d，每隔一定時間用飽和正丁醇終止反應(yīng)，然后進行TLC和HPLC分析.

1.8 內(nèi)生菌D19的DNA提取、PCR擴增及克隆測序

在光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)生菌D19的微觀形態(tài).采用氯化芐法提取內(nèi)生菌D19基因組總DNA，先用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3′)和1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)進行PCR擴增[16].PCR反應(yīng)體系(20 μL)為： dNTPs 2 μL， 10×PCR緩沖液(Mg2+) 2 μL，引物各2 μL， DNA模板2 μL，超純水10 μL.PCR擴增程序為：首先在95 ℃預(yù)變性3 min； 然后在95 ℃變性30 s， 在56 ℃退火30 s， 在72 ℃延伸90 s，進行30個循環(huán);最后在72 ℃延伸7 min.PCR產(chǎn)物切膠回收，將目的片段與載體pMD -18T連接后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞(JM109)，在LB平板(含氨芐)上進行藍白斑篩選；挑取白斑在液體培養(yǎng)基中進行搖菌，然后用M13引物(T載體上的測序引物)進行菌液PCR，最后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序.

將測得的基因序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進行對比分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，其中相似的序列進行多重匹配排列分析(clustalx 1.83)，然后用Mega 4.0[17]分析軟件中的Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.9 TLC法測定人參皂苷

TLC展開劑為氯仿-甲醇-水(體積比為10∶5∶1)，展開后用10%硫酸乙醇溶液顯色，并與標(biāo)準(zhǔn)品Rf值比對，以此初步判斷樣品中是否有稀有人參皂苷的生成.

1.10 HPLC法測定人參皂苷

高效液相色譜儀HP 1100， UV檢測器，色譜柱采用BDS HYPERSIL C18 (250 mm×4.6 mm)，檢測波長為203 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫25 ℃，流動相為水(A)-乙腈(B)溶液，梯度洗脫，條件如表1.

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 黨參內(nèi)生菌的分離篩選

從黨參中共分離得到32種內(nèi)生菌，篩選出15種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的內(nèi)生菌，其中內(nèi)生菌D19顯示出較好的人參皂苷生物轉(zhuǎn)化活性.由圖1可以看出，菌株D19菌體呈油狀(黃色)、有隆起，為細菌形態(tài)特征.

圖1 內(nèi)生菌D19在PDA培養(yǎng)基上的生長特性

2.2 發(fā)酵條件對人參根總皂苷生物轉(zhuǎn)化的影響

通過人參皂苷活性篩選實驗，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌D19能夠有效地將人參根總皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷F2、C-K和Rh1.為了得到較高產(chǎn)率的稀有人參皂苷，探討培養(yǎng)基、pH值對內(nèi)生菌D19轉(zhuǎn)化人參根總皂苷的影響，確定最佳生物反應(yīng)條件.

由圖2可知，當(dāng)水為培養(yǎng)基時內(nèi)生菌D19能有效地將人參根總皂苷中的主皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷F2和C-K，而培養(yǎng)基為R2A和PDB時，仍有較多未轉(zhuǎn)化的人參主皂苷Rb1，因此本文選擇水為最適培養(yǎng)基.

由圖3可知，在最適培養(yǎng)基中，菌株在整個pH值范圍內(nèi)對主皂苷Rb1、Rb2和Rc均有較好的轉(zhuǎn)化能力，在3.0～7.0 pH值范圍內(nèi)都能產(chǎn)生稀有人參皂苷F2和C-K，其中pH值為5.0時轉(zhuǎn)化效果最好，因此本文選擇pH 5.0為最適pH值.

圖2 內(nèi)生菌D19在不同培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化人參根總皂苷的TLC圖 (1為水； 2為R2A； 3為PDB； 4為LB； 5為NB； 6為LL； S1、S2為標(biāo)準(zhǔn)品)

圖3 內(nèi)生菌D19在不同pH條件下轉(zhuǎn)化人參根總皂苷的TLC圖 (1為3.0； 2為4.0； 3為5.0； 4為6.0； 5為7.0； 6為8.0； 7為9.0； 8為10.0； S1、S2為標(biāo)準(zhǔn)品)

2.3 內(nèi)生菌D19對人參根總皂苷的微生物轉(zhuǎn)化

在100 mL錐形瓶中加入60 mL水和0.9 g人參根總皂苷粉末，pH值為5.0，經(jīng)高壓蒸氣滅菌鍋滅菌后，進行生物轉(zhuǎn)化實驗.發(fā)酵10 d后對發(fā)酵液進行HPLC分析(圖4).通過發(fā)酵前后人參皂苷含量的變化可知，發(fā)酵后Rb2、Rd、Rg1和Re的含量明顯減少，Rb1幾乎完全轉(zhuǎn)化，且稀有人參皂苷F2、C-K和Rh1的含量均有不同程度的增加.HPLC分析結(jié)果顯示，最佳生物反應(yīng)條件下稀有人參皂苷F2、C-K和Rh1的最高產(chǎn)率分別為30%、17%和8%.

圖4 內(nèi)生菌D19發(fā)酵人參根總皂苷的HPLC譜圖

2.4 內(nèi)生菌D19對單體皂苷的生物轉(zhuǎn)化

為了探明稀有人參皂苷Rh1、F2和C-K的來源，利用內(nèi)生菌D19分別對人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd和Rg1進行轉(zhuǎn)化實驗.

利用內(nèi)生菌D19對人參二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd進行轉(zhuǎn)化，通過轉(zhuǎn)化前后的TLC對比可知(圖5)，內(nèi)生菌D19能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b1和Rd轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷C-K，還能將人參皂苷Rb1、Rc和Rd轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷F2，并在人參皂苷Rb2的轉(zhuǎn)化中，生成稀有人參皂苷C-Y，因此可以確定稀有人參皂苷F2和C-K是由Rb1、Rb2、Rc和Rd等人參二醇類皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)生.

圖5 內(nèi)生菌D19轉(zhuǎn)化二醇類單體皂苷的TLC圖 (底物：1為Rb1； 2為Rb2； 3為Rc； 4為Rd； S為標(biāo)準(zhǔn)品)

利用內(nèi)生菌D19對人參三醇類皂苷Rg1進行轉(zhuǎn)化，通過轉(zhuǎn)化前后的TLC對比可知(圖6)，內(nèi)生菌D19能夠?qū)⑷藚⒃碥誖g1轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rh1和F1，因此可以確定稀有人參皂苷Rh1是由Rg1等人參三醇類皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)生.

圖6 內(nèi)生菌D19轉(zhuǎn)化三醇類單體皂苷Rg1的TLC圖 (D19為Rg1的內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物； S為標(biāo)準(zhǔn)品)

2.5 內(nèi)生菌D19對單體皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化路徑

以人參皂苷Rb1為例，探討內(nèi)生菌D19對單體皂苷的轉(zhuǎn)化路徑.微生物轉(zhuǎn)化實驗過程中，每隔一定時間取樣，進行HPLC分析，并利用人參皂苷峰面積變化與發(fā)酵時間的關(guān)系作圖(圖7).從圖7可以看出：反應(yīng)開始后，底物人參皂苷Rb1的含量急劇下降，直到3 h后被完全水解；人參皂苷Rd的含量隨Rb1的減少而逐漸增多，4 h后隨F2的急劇上升而迅速下降，直至完全消失；人參皂苷F2的含量在Rd產(chǎn)生后逐漸增加，在Rd趨于消失時達到最大值，后隨C-K的產(chǎn)生而逐漸下降；人參皂苷C-K在24 h后生成，含量隨F2的下降而增加，直到反應(yīng)結(jié)束.因此，可以推測內(nèi)生菌D19對單體皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化路徑為Rb1→Rd→F2→C-K(圖8).

2.6 內(nèi)生菌D19的鑒定

由圖9可以看出，內(nèi)生菌D19為大小均勻、規(guī)則的桿形細菌.內(nèi)生菌D19通過16S rDNA提取，PCR擴增，質(zhì)粒重組等一系列操作后，得到的凝膠電泳圖(圖10)中顯示DNA的片段大小約為1 600 bp.通過與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行對比分析，找到與內(nèi)生菌D19相似的物種基因，然后利用Clustal X進行多重序列分析，使用Mega 4.0軟件進行鄰接法聚類分析，最終得到內(nèi)生菌D19的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖11).以上分析表明，內(nèi)生菌D19歸屬于藤黃色桿菌屬(Dyella)，與DyellaginsengsoilstrainLA-4相似性達到97%.

圖7 內(nèi)生菌D19轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1過程中峰面積的變化與發(fā)酵時間的關(guān)系圖

圖8 內(nèi)生菌D19轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化路徑

圖9 內(nèi)生菌D19在光學(xué)顯微鏡下的微觀形態(tài)

圖10 內(nèi)生菌D19重組質(zhì)粒DNA的凝膠電泳圖

圖11 內(nèi)生菌D19的無根系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

從黨參中分離得到能夠?qū)⑷藚⒏傇碥罩械腞b1、Rb2、Rc、Rd和Rg1等轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷F2、C-K和Rh1的內(nèi)生菌D19，在最佳轉(zhuǎn)化條件(水為培養(yǎng)基、pH 5.0)下F2、C-K和 Rh1的最高產(chǎn)率分別為30%、17%和8%.單體皂苷的轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，稀有人參皂苷F2和C-K是由Rb1、Rb2、Rc和Rd等人參二醇類皂苷轉(zhuǎn)化，而稀有人參皂苷Rh1是由Rg1等人參三醇類皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)生.菌株D19對人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化路徑為Rb1→Rd→F2→C-K.通過16S rDNA序列分析，鑒定內(nèi)生菌D19為藤黃色桿菌屬(Dyella).

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Study on biotransformation of ginseng root saponins to minor ginsenosides F2 and C-K by endophyte from Codonopsis pilosula

CUI Lei1, JIN Yingjin2, YIN Chengri1,2*

( 1.DepartmentofChemistry，CollegeofScience; 2.AnalyticalandTestingCenter:YanbianUniversity,Yanji133002,China)

A total of 32 kinds of endophytes formCodonopsispilosulawere isolated through the method of organizational separation. Among these endophytes, strains D19 showed the strongest activities to convert major ginsenosides to minor ginsenosides. When in the medium of H2O, pH of 5.0, the maximum yield of minor ginsenosides F2, C-K and Rh1 reached to 30%, 17% and 8%, respectively. The source of minor ginsenosides and the transformation pathway of ginsenoside Rb1 were confirmed according to the saponin monomer conversion experiments. Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences indicated that the strain D19 belongs to the genusDyella.

Codonopsispilosula； minor ginsenosides； endophytes； biotransformation

2014-12-07 *通信作者： 尹成日(1963—)，男，博士，教授，研究方向為天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化.

吉林省自然科學(xué)基金資助項目(2015—2017);國家自然科學(xué)基金資助項目(20862017)

1004-4353(2015)01-0079-06

Q815

A