謝曉麗，孫振宇，劉長仲

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省植保植檢站，甘肅蘭州 730020；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅蘭州 730070）

中國小麥條銹菌分子標(biāo)記技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用綜述

謝曉麗1，2，孫振宇3，劉長仲1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省植保植檢站，甘肅蘭州 730020；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅蘭州 730070）

概述了小麥條銹病早期定性、定量監(jiān)測，介紹了小麥條銹菌種內(nèi)特異性引物的設(shè)計及應(yīng)用，主要包括小麥條銹菌生理小種的特異性標(biāo)記開發(fā)和小麥條銹菌小種特異性引物的應(yīng)用。

小麥條銹菌；監(jiān)測預(yù)警；潛育期；早期檢測；生理小種；分子標(biāo)記

小麥條銹病是我國小麥生產(chǎn)上的主要流行病害之一，曾造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)，對我國糧食安全造成嚴(yán)重威脅［1～2］。該病害在我國呈大區(qū)域流行的特點(diǎn)，其病原菌小麥條銹菌（Puccinia striiformis f. sp.Tritici）為典型的專性寄生真菌，在我國大多病害發(fā)生區(qū)域并不能完成整個生活史中至關(guān)重要的越夏和越冬環(huán)節(jié)。陳萬權(quán)等系統(tǒng)分析了小麥條銹菌菌源傳播規(guī)律后發(fā)現(xiàn)，中國小麥條銹病存在兩大菌源基地，分別為秋季菌源和春季菌源，提出了病害源頭治理的策略［3］。目前化學(xué)藥劑的使用和抗病品種的推廣應(yīng)用仍是我國小麥條銹病防控的主要手段［4～5］。早期監(jiān)測預(yù)警是小麥條銹病綜合防控的首要環(huán)節(jié)，分子生物學(xué)技術(shù)在植物病害研究領(lǐng)域的應(yīng)用，使病害的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早防治成為可能。另外由于小麥條銹菌的高變異特性，其生理小種的監(jiān)測常作為對該病害流行預(yù)測預(yù)報及小麥抗病育種的重要依據(jù)之一。小麥條銹菌特異性分子標(biāo)記的開發(fā)，以及各生理小種特異性分子標(biāo)記的開發(fā)，都將大大提高小麥條銹病監(jiān)測的準(zhǔn)確率及防控的時效性，降低防控成本，對抗病育種工作產(chǎn)生重要影響。我們統(tǒng)計整理了我國小麥條銹菌及其生理小種的分子標(biāo)記研究相關(guān)成果，及其在相關(guān)研究中的應(yīng)用概況，以期為小麥條銹病的防控及抗病育種工作提供參考。

1 小麥條銹病早期檢測

1.1 小麥條銹菌的定性監(jiān)測

根據(jù)外界環(huán)境條件不同，小麥條銹菌侵染小麥葉片后，需經(jīng)過7～10 d左右的潛育期才可顯癥，因此小麥條銹病的早期監(jiān)測對于小麥條銹病的防控尤為重要。小麥條銹病的早期監(jiān)測是通過小麥條銹菌的特異性標(biāo)記的開發(fā)來實(shí)現(xiàn)的（表1）。Zhao等根據(jù)小麥條銹菌的ITS序列，設(shè)計種特異性引物，反應(yīng)體系中小麥條銹菌DNA量達(dá)到0.1 pg即可檢測［6］。Cao等根據(jù)小麥條銹菌β-微管蛋白基因序列設(shè)計兩對小麥條銹菌的特異性引物，其中引物組合YR（f）/YR（r1）可在小麥條銹菌侵染2 d的小麥葉片中檢測到小麥條銹菌DNA［7］。Wang等設(shè)計特異性引物并優(yōu)化試驗(yàn)體系，其檢測靈敏度達(dá)到10 pg，可在溫室接種及田間采集的小麥葉片中檢測到潛育期的小麥條銹菌，實(shí)現(xiàn)對小麥條銹病的早期檢測，并申請專利［8～9］。為提高小麥條銹菌分子檢測的靈敏度，在前期工作基礎(chǔ)上，根據(jù)小麥條銹菌的PSR序列設(shè)計引物，利用巢式PCR反應(yīng)監(jiān)測小麥條銹菌，其靈敏度可達(dá)1 fg，可在接種24 h后的小麥葉片中檢測到小麥條銹菌的侵入［10～11］。為了簡化小麥條銹菌監(jiān)測的步驟，Sun等設(shè)計了2對小麥條銹菌特異性引物并優(yōu)化反應(yīng)體系，利用單管巢式PCR反應(yīng)，使小麥條銹菌檢測的靈敏度達(dá)到20 fg，可在接種24 h的小麥葉片中檢測到小麥條銹菌DNA，并申請發(fā)明專利［12～13］。Huang等根據(jù)小麥條銹菌β-微管蛋白基因序列設(shè)計引物，利用Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）技術(shù)實(shí)現(xiàn)僅通過反應(yīng)體系顏色的變化來檢測小麥條銹菌侵入的目的，并且其檢測精度達(dá)到2 pg，在接種24 h的小麥葉片中也可檢測到小麥條銹菌的侵入［14］。

小麥條銹病的早期檢測技術(shù)主要還是應(yīng)用于研究中?？仔掠畹韧ㄟ^將冬前定點(diǎn)的小麥植株移栽到溫室觀察和熒光定量PCR方法，分別分析了甘肅省小麥條銹菌的潛育越冬情況，驗(yàn)證了小麥條銹菌在甘肅隴南和隴東地區(qū)越冬的可能性，并分析認(rèn)為，熒光定量PCR方法較觀察法更為準(zhǔn)確，也進(jìn)一步說明小麥條銹病的早期檢測的可行性［15］。

表1 小麥條銹菌特異性引物序列

1.2 小麥條銹菌的定量監(jiān)測

定量PCR技術(shù)為實(shí)現(xiàn)小麥條銹菌的定量監(jiān)測提供了技術(shù)支持。潘娟娟等根據(jù)小麥條銹菌β-微管蛋白基因序列設(shè)計特異性引物，利用Real-time PCR可在接種12 h的小麥葉片中檢測到小麥條銹菌DNA，并建立小麥條銹菌的早期定量測定方法［16］。依據(jù)所建立的小麥條銹菌早期定量測定方法，潘娟娟定義并測定了分子檢測病情指數(shù)MDX，根據(jù)其與實(shí)際發(fā)病最終病情指數(shù)DX關(guān)聯(lián)性建立預(yù)測方程，通過甘肅和北京兩地試驗(yàn)田塊定點(diǎn)取樣初步驗(yàn)證小麥條銹菌早期定量監(jiān)測的可行性［17］。閆佳會等應(yīng)用潘娟娟等建立的小麥條銹菌早期定量測定方法，建立了分子病情指數(shù)（molecular-detected disease index，MDI）與田間發(fā)病病情指數(shù)（disease index，DI）之間的回歸模型，進(jìn)一步驗(yàn)證了小麥條銹菌早期定量監(jiān)測的可行性及其在小麥條銹病監(jiān)測中的重要作用［18］。

2 小麥條銹菌種內(nèi)特異性引物的設(shè)計及應(yīng)用

2.1 小麥條銹菌生理小種特異性標(biāo)記的開發(fā)

研究表明，小麥品種抗性一般在3～5 a即被小麥條銹菌所克服而喪失抗性［3］，這與小麥條銹菌的高變異特性有關(guān)，因此小麥條銹菌生理小種的監(jiān)測對于小麥育種及對小麥條銹病的流行預(yù)測具有重要意義。目前，我國小麥條銹菌的毒性變異監(jiān)測主要靠觀測其在一系列鑒別寄主品種上的反應(yīng)型來實(shí)現(xiàn)，小麥條銹菌生理小種的監(jiān)測工作是通過田間標(biāo)樣的采集、病原菌的純化繁殖、及其在一系列鑒別寄主上的反應(yīng)型鑒定來完成的，鑒定工作需要較長的周期和較高的專業(yè)及環(huán)境要求。因而小麥條銹菌生理小種快速鑒定技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用就顯得尤為重要，快速檢測技術(shù)的建立是以小種特異性標(biāo)記的開發(fā)為前提的。

曹麗華等研究得到條中31號等4個生理小種的RAPD標(biāo)記，證明了小麥條銹菌生理小種分子檢測的可行性［19］?？嫡裆壤脳l中29號特異性RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化得到該小種的1對SCAR標(biāo)記［20］，曹麗華等、張勃等、郝保軍等、仲軍和胡小平等先后得到了條中31號、條中32號、條中33號及條中17號等當(dāng)時主要流行小種的SCAR標(biāo)記［21～25］（表2）。這些分子標(biāo)記的建立，填補(bǔ)了我國小麥條銹菌生理小種研究中的空白，為小麥條銹菌生理小種的分子鑒定工作提供了可能，其完善及應(yīng)用將大大提高我國小麥條銹菌生理小種監(jiān)測的效率。

2.2 小麥條銹菌小種特異性引物的應(yīng)用

李進(jìn)斌等應(yīng)用5個小麥條銹菌主要流行小種的特異性標(biāo)記，分析了云南省2個縣的小麥條銹菌群體，結(jié)果表明，條中29和條中32兩個生理小種特異性分子標(biāo)記的檢出率最高，且單片病葉上能檢測到多個小種特異性標(biāo)記［26］。李進(jìn)斌等應(yīng)用相同研究方法研究了不同栽培模式下小麥條銹菌群體的變化，結(jié)果表明品種混種可顯著降低相應(yīng)優(yōu)勢小種標(biāo)記的檢出率，并有效減少單病葉中的小種數(shù)量［27］。這些研究結(jié)果表明，小麥條銹菌小種分子標(biāo)記的應(yīng)用拓寬了病原菌監(jiān)測的研究領(lǐng)域，提高了小麥條銹菌群體分析的工作效率。

表2 小麥條銹菌生理小種特異性引物名稱及序列

3 結(jié)束語

病原菌的早期檢測對于病害防控尤其是流行性病害的防控意義重大。小麥條銹病屬于典型的氣傳病害，本地菌源作為初始菌源的區(qū)域，早期病原菌的陽性監(jiān)測點(diǎn)即為該地發(fā)病中心，對于發(fā)病中心范圍內(nèi)植株的藥劑治療和保護(hù)將有效的降低甚至消除發(fā)病隱患，有效控制當(dāng)?shù)氐某跏季磾?shù)量，實(shí)現(xiàn)病害防控的X0策略。并且該地域往往作為小麥條銹病的菌源基地，病原菌的早期檢測防控也將有效降低其外傳菌源量，這些對于外來菌源作為初始菌源的區(qū)域有重大意義，因此小麥條銹菌菌源基地的界定對于小麥條銹病的防控至關(guān)重要。小麥條銹菌的早期檢測，為小麥條銹病越夏和越冬區(qū)域范圍的界定提供有力支持，有利于及時準(zhǔn)確的防控，降低防控成本。

病原菌毒性變異監(jiān)測對育種及品種布局有重要指導(dǎo)意義。當(dāng)前小麥條銹菌的毒性變異監(jiān)測工作繁瑣，需要大量人力物力的投入，而且易受人員經(jīng)驗(yàn)及外界環(huán)境因素的影響。分子標(biāo)記的開發(fā)與利用將大大提高小麥條銹菌毒性變異監(jiān)測的工作效率與準(zhǔn)確度，其結(jié)果為育種工作指明了方向，同時也是利用品種布局來有效控制小麥條銹病的重要參考。然而小麥條銹菌生理小種繁多，且小麥條銹菌具高變異的特性，目前已定名的有條中1-33號，以及諸多的致病類群，但進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)時，只能兼顧到當(dāng)時的主要流行小種，不能很好的將所有生理小種進(jìn)行區(qū)分，而且由于小麥條銹菌生理小種的復(fù)雜性，每個特異性標(biāo)記所能代表的群體或者個體限制較大，現(xiàn)有的分子標(biāo)記尚不能應(yīng)用到小麥條銹菌生理小種的鑒定工作中，因此小麥條銹菌分子檢測體系還需隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展而不斷完善。

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（本文責(zé)編：楊杰）

Research and Application of Molecular Markers Technology of Puccinia striiformis in China

XIE Xiao-li1，2，SUN Zhen-yu3，LIU Chang-zhong1

（1.College of Prataculture Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou Gansu 730070，China；2.Gansu Plant Protection Station，Lanzhou Gansu 730020，China；3.Institute of plant protection，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070）

In this paper，outlined an early qualitative and quantitative monitoring of the Puccinia striiformis f.sp.Tritici，introduced the design and application of species specific primer of Puccinia striiformis f.sp.Tritici fungus，mainly includes the development of the specific markers of physiological races of Puccinia striiformis f.sp.Tritici races，and application of the specific primers of Puccinia striiformis race.

Puccinia striiformis；Monitoring and early warning；Incubation period；Early detection；Physiological race；Molecular markers

Q943；S512.1

A

1001-1463（2015）05-0046-05

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.05.015

2015-02-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301605）部分內(nèi)容

謝曉麗（1985—），女，甘肅民勤人，主要從事農(nóng)作物病蟲害防治工作。聯(lián)系電話：（0）15682846257。E-mail：403325389@qq.com

劉長仲（1962—），男，重慶人，教授，主要從事昆蟲生態(tài)及害蟲治理研究。聯(lián)系電話：（0）13919179962。E-mail：liuchzh@gsau.edu.cn