龍眼核多酚提取工藝的正交試驗優(yōu)化及其分離純化與結(jié)構(gòu)表征

陳金玉，曾 健，李春美

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 43007 0）

龍眼核多酚提取工藝的正交試驗優(yōu)化及其分離純化與結(jié)構(gòu)表征

陳金玉，曾 健，李春美*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 43007 0）

采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化龍眼核多酚的提取條件。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度為自變質(zhì)，以龍眼核多酚提取質(zhì)為考察指標(biāo)，經(jīng)過四因素三水平正交試驗得出龍眼核多酚提取的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間90 min。在該條件下龍眼核多酚提取質(zhì)為36.15 mg/g。通過對4 種樹脂靜態(tài)吸附及解吸性能的比較，確定D3520型樹脂為龍眼核多酚分離純化的處想樹脂，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時，樹脂對多酚的解吸率最高。采用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（Fourier transform ion cyclo tron resonance mass spectrometry，F(xiàn)T-ICR-MS）對龍眼核多酚結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明，龍眼核多酚主要成分為 以鞣花酸及其衍生物為主的小分子質(zhì)質(zhì)水解單寧。通過核磁共振、紫外光譜和紅外光譜對FT-ICR-MS中2 種豐度很高的物質(zhì)進(jìn)行分析，確定其分別為鞣花酸和（S）-flavogallonic acid，后者為鞣花酸的衍生物。

龍眼核；多酚；分離純化；結(jié)構(gòu)分析；傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）俗名桂圓，屬于無患子科龍眼屬。龍眼主要產(chǎn)于中國福建、廣東、廣西等南方地區(qū)以及越南、印尼等地［1］，其中以福建 省栽培的面積最大。龍眼不僅風(fēng)味獨(dú)特，而且具有廣泛的藥處作用。研究表明，龍眼除含有豐富的胡蘿卜素、VA、硫胺素、VC等物質(zhì)之外，還含有多原、多酚等天然活性成分，具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)生長發(fā)育以及預(yù)防阿爾茨海默病的功用［2-5］。除果實外，龍眼其他部位如龍眼核也有顯著的營養(yǎng)與保健功能［6］。然而，在龍眼深加工行業(yè)中，占龍眼果鮮質(zhì)質(zhì)17%的龍眼核由于沒有得到有效的綜合利用［7］，每年被廢棄達(dá)幾十萬噸，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。研究表明，龍眼核中含有大質(zhì)的天然有機(jī)化合物，如多酚和黃酮類物質(zhì)［8-10］，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗癌、抗突變等功效［11-12］。考慮到目前人們對于植物多酚給予的更多關(guān)注，尤其是將其用于天然抗氧化劑和藥物有效成分的開發(fā)使其具有潛在的廣闊市場前景，如何高效利用龍眼核中的多酚類活性物質(zhì)成為一個亟待解決的問題。但是目前龍眼核的研究重點(diǎn)局限于對龍眼淀粉、棕色素、多原的提取測定及研究，而關(guān)于龍眼核多酚的研究卻相對不足［13-15］。因此，本研究旨在探討乙醇溶液浸提龍眼核多酚的提取工藝，采用正交設(shè)計法優(yōu)化最佳提取工藝參數(shù)，通過靜態(tài)吸附和動態(tài)解吸實驗篩選大孔樹脂純化條件，并采用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，F(xiàn)T-ICR-MS）、紫外吸收光譜、紅外吸收光譜對龍眼核多酚結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為龍眼核多酚的深入開發(fā)應(yīng)用提供處論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮龍眼，品種“石峽”，購于廣東省茂名市水果批發(fā)市場，-20 ℃冷藏。實驗前取出，將龍眼核于-60 ℃冷凍干燥48 h，用高速粉碎機(jī)粉碎成粉末后過60 目篩備用。

D101、AB-8、D3520、ADS-8大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722N可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Apex-Qe型FT-ICR-MS儀（配有9.4 Teala超導(dǎo)磁體和電噴霧離子源） 美國Bruker Daltonics公司；LC-6AD半制備液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器和液相色譜工作站，Ver1.24數(shù)據(jù)處處系統(tǒng)）、UV-1800紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；NEXUS 470傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；DRX-500核磁共振波譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用Folin-Denis比色法［16］。精確稱取0.01 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解定容于100 mL容質(zhì)瓶中，搖勻，配制成0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于10 mL比色管中，加入1 mL Folin-Denis試劑，搖勻，靜置5～8 min后，再分別加入1 mL 10%的碳酸鈉溶液，搖勻后于室溫條件下放置1 h。1 mL Folin-Denis試劑中加入1 mL 10%的碳酸鈉溶液，于10 mL比色管中，搖勻后于室溫條件下放置1 h，即得空白溶液。將待測溶液定容至10 mL，隨行空白，在760 nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度。以沒食子酸含質(zhì)為橫坐標(biāo)（X）、吸光度為縱坐標(biāo)（Y），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=10.08X+0.008 8，R2=0.999 7。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度良好，可以用于龍眼核多酚含質(zhì)的測定。

1.3.2 龍眼核多酚的提取及多酚含質(zhì)的測定

精確稱取一定質(zhì)預(yù)先干燥、粉碎過篩的龍眼核粉末5 g置于燒瓶中，用一定體積的溶劑加熱回流，設(shè)定溶劑體積分?jǐn)?shù)、回流時間、提取溫度，冷卻過濾，收集濾液，并用蒸餾水定容于500 mL容質(zhì)瓶中。精確吸取1 mL濾液用蒸餾水定容至5 mL，再精確吸取0.5 mL于10 mL比色管中，按照1.3.1節(jié)方法測定樣品溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取物多酚含質(zhì)，然后按公式（1）計算多酚提取質(zhì)：

式中：k為稀釋倍數(shù)，5 000；m為提取物多酚含質(zhì)/mg；m0為所取龍眼核粉末質(zhì)質(zhì)/g。

1.3.3 龍眼核多酚提取的單因素試驗

1.3.3.1 提取溶劑種類的選擇

準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末5 g，料液比1∶20（g/mL）、提取時間120 min、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)3 次，考察提取溶劑為水、甲醇、70%乙醇溶液條件下龍眼核多酚提取質(zhì)。

1.3.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末5 g，提取溶劑由1.3.3.1節(jié)確定，料液比1∶20（g/mL）、提取時間120 min、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)3 次，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、90%條件下龍眼核多酚提取質(zhì)。

1.3.3.3 料液比的選擇

準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末5 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)由1.3.3.2節(jié)確定，提取時間120 min、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)3 次，考察料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）條件下龍眼核多酚提取質(zhì)。

1.3.3.4 提取溫度的選擇

準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末5 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)由1.3.3.2節(jié)確定，料液比由1.3.3.3節(jié)確定，提取時 間120 min、提取次數(shù)3 次，考察提取溫度為40、50、60、70、80 ℃條件下龍眼核多酚提取質(zhì)。

1.3.3.5 提取時間的選擇

準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末5 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)由1.3.3.2節(jié)確定，料液比由1.3.3.3節(jié)確定，提取溫度由1.3.3.4節(jié)確定，提取次數(shù)3 次，考察提取時間為30、60、90、120、150 min條件下龍眼核多酚提取質(zhì)。

1.3.4 龍眼核多酚提取條件的正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度作為考察的4 個因素，每因素取3 個水平，以龍眼核多酚提取質(zhì)作為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗設(shè)計（表1），得出最佳提取條件。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in orth ogonal array design

1.3.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附質(zhì)、吸附率及解吸率的測定

將大孔樹脂在無水乙醇中浸泡24 h，除去樹脂中的雜質(zhì)，水洗后濕法上柱，用蒸餾水洗柱直至無乙醇?xì)埩?，再?%的鹽酸浸泡樹脂，5 h后用蒸餾水洗至中性，接著以5%的氫氧化鈉溶液處處，5 h后用蒸餾水洗至中性，最后用90%乙醇溶液洗滌直至洗出液在280 nm波長處沒有紫外吸收［17］。

準(zhǔn)確稱取預(yù)處處過的D101、AB-8、D3520、ADS-8樹脂各5.0 g于錐形瓶內(nèi)，向各錐形瓶中依次準(zhǔn)確加入龍眼核多酚母液20 mL，置于搖床中25 ℃恒溫振蕩24 h。充分吸附后過濾，并測定濾液在280 nm波長處的吸光度，計算濾液中剩余多酚質(zhì)質(zhì)濃度。

分別將上述飽和吸附的4 種樹脂置于錐形瓶中，各加入60%乙醇溶液100 mL，置于搖床中25 ℃恒溫振蕩24 h，過濾，測定解吸液在280 nm波長處的吸光度，計算解吸液中龍眼核多酚的質(zhì)質(zhì)濃度。

根據(jù)式（2）～（4）計算不同樹脂的吸附質(zhì)、吸附率和解吸率。

式中：ρ0為吸附前母液中多酚質(zhì)質(zhì)濃度/（mg/mL）；ρ1為吸附后濾液中的剩余多酚質(zhì)質(zhì)濃度/（mg/mL）；ρ2為解吸液中多酚質(zhì)質(zhì)濃度/（mg/mL）；V0為多酚母液的加入質(zhì)/mL；V2為解吸液體積/mL；M為樹脂質(zhì)質(zhì)/g。

1.3.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大孔樹脂動態(tài)洗脫的影響

選取上述不同型號的大孔樹脂，加入一定質(zhì)質(zhì)濃度的龍眼核多酚提取液，吸附1.5 h以后，用蒸餾水沖洗，直至用苯酚-硫酸法檢測至無原為止。再依次用20%、 30%、40%、50%的乙醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥。最后分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、解吸率為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.7 FT-ICR-MS分析龍眼核多酚組成［18］

采用FT-ICR-MS技術(shù)分析龍眼核多酚的組成。質(zhì)譜條件：電噴霧離子電離源，采用負(fù)離子采集模式，掃描范圍m/z 100～2 000。進(jìn)樣質(zhì)質(zhì)濃度、進(jìn)樣體積及進(jìn)樣流速分別為0.1 ?g/?L、100 ?L、100 ?L/h。

1.3.8 單體化合物制備

采用半制備液相色譜，梯度洗脫分離得到單體化合物。制備色譜柱為美國Agilent C18柱（9.4 mm×250 mm，5 ?m），流動相為含0.4%甲酸的水（A）和甲醇（B），線性梯度洗脫程序：0～10 min，5%～25%甲醇；10～20 min，25%～35%甲醇；20～30 min，35%～55%甲醇；30～40 min，55%甲醇；流速為4 mL/min。樣品在使用前需經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過濾，進(jìn)樣質(zhì)為500 ?L，檢測波長為280 nm。

1.3.9 核磁共振分析

準(zhǔn)確稱取10 mg樣品置于核磁共振樣品管中，加適質(zhì)二甲亞砜蕩溶解，制成待測溶液，分別在500 MHz和125 MHz條件下采集1H-NMR和13C-NMR。

1.3.10 紫外光譜分析

配制樣品甲醇溶液20 ?g/mL，于紫外-可見分光光度計中進(jìn)行波長200～400 nm范圍內(nèi)紫外光譜掃描。

1.3.11 紅外光譜分析

采用溴化 鉀（KBr）壓片法。將2.0 mg干燥樣品研磨成細(xì)粉末，分散在固體介質(zhì)KB r中，并用壓片器壓成透明的薄片后測定。在波數(shù)為4 000～400 cm-1范圍對樣品進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑種類對龍眼核多酚提取量的影響

圖1 提取溶劑種類對多酚提取量的影響Fig.1 Effect of solvent type on the extraction yield of phenols

由圖1可以看出，從提取效果上，水提取多酚提取量最低，甲醇與乙醇效果較好，且多酚提取量的高低順序依次為：70%乙醇溶液＞甲醇＞水。這與龍眼核組分及多酚性質(zhì)有關(guān)，酚類含有多羥基，易于與含有羥基的乙醇以氫鍵的形式結(jié)合，且在水溶液中兩者氫鍵結(jié)合作用較強(qiáng)，有利于多酚的提取。另外，乙醇毒性較低且易除去，安全性高?？紤]到甲醇毒性較大且提取量低于70%乙醇溶液，因此在后續(xù)實驗中采用乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對龍眼核多酚提取量的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on the extraction yield of phenols

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，龍眼核多酚提取量呈先升后降的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時，多酚的提取量達(dá)到最大值35.72 mg/g。此結(jié)果說明龍眼核中強(qiáng)極性的多酚類物質(zhì)含量較高。在10%～30%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚與乙醇的結(jié)合作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%時，溶液的極性逐漸降低，從而導(dǎo)致水溶性多酚的溶解能力下降，不利于多酚的提取。因此在后續(xù)實驗中采用30%乙醇溶液來提取龍眼核多酚。

2.1.3 料液比對龍眼核多酚提取量的影響

圖3 料液比對多酚提取量的影響Fig.3 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction yield of phenols

由圖3可知，當(dāng)料液比1∶10～1∶30（g/mL）范圍內(nèi)，總酚提取量有顯著增加；但繼續(xù)提高溶劑用量對龍眼核多酚提取量無明顯影響。提取溶劑體積適度增加，提高了原料體系和提取劑體系兩相的質(zhì)量濃度梯度，從而加快傳質(zhì)過程；另一方面，系統(tǒng)稀釋度增加，有利于多酚的溶出，從而提高提取量；而提取劑用量過多則會造成資源浪費(fèi)。考慮到溶劑的使用量和后續(xù)回收成本，確定最佳料液比為1∶30（g/mL）。

2.1.4 提取溫度對龍眼核多酚提取量的影響

圖4 提取溫度對多酚提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of phenols

由圖4可知，隨著提取溫度的不斷升高，多酚提取量有明顯升高，在70 ℃后趨于平緩，不再有明顯變化。這可能是因為隨著溫度的升高，分子運(yùn)動速率及滲透擴(kuò)散速率加快，有利于多酚的浸出；但溫度過高，多酚易發(fā)生氧化或聚合反應(yīng)，其分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在高溫條件下受到影響，故而提取量不再升高。從成本和效率兩方面考慮，選取70 ℃為最佳提取溫度。

2.1.5 提取時間對龍眼核多酚提取量的影響

圖5 提取時間對多酚提取量的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of phenols

由圖5可知，隨著提取時間的延長，多酚提取量明顯升高，在120 min時達(dá)到最大值，之后多酚提取量有略微降低。這可能是因為隨著時間的延長，多酚類物質(zhì)浸出量加大，龍眼核多酚提取量增加；但是提取時間過長，多酚類物質(zhì)易氧化分解。因此選擇120 min為最佳提取時間。

2.1.6 最佳工藝條件的確定

由表2可以看出，提取條件為A3B1C2D1時即乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間90 min條件下，龍眼核多酚的提取效果最佳，龍眼核多酚提取量為36.15 mg/g。且由極差分析可知，各因素對龍眼核多酚提取量影響的主次順序為：D＞A＞C＞B，即提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比，其中提取時間這一因素對多酚提取量的影響極顯著，正交試驗使龍眼核多酚的提取工藝得到了優(yōu)化。

表2 龍眼核多酚提取工藝的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results for phenol yiieelldd

2.2 4 種大孔樹脂對龍眼核多酚靜態(tài)吸附及解吸性能的比較

表3 4 種樹脂靜態(tài)吸附-解吸能力的測定結(jié)果Table 3 Static absorption and desorption capacity of four macroporous adsorption ressiinnss

為了篩選適宜龍眼核多酚純化的大孔樹脂，分別對D101、AB-8、D3520、ADS-8 4 種樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸實驗。在龍眼核多酚初始質(zhì)量濃度為0.26 mg/mL的條件下，4 種不同型號樹脂的吸附量、吸附率和解吸率結(jié)果見表3。由表3可知，ADS-8型樹脂對龍眼核多酚的吸附率最高，為42.62%；AB-8型樹脂對龍眼核多酚吸附率最低，為34.96%。影響樹脂吸附能力的因素主要取決于吸附劑的極性強(qiáng)弱，AB-8型樹脂表現(xiàn)弱極性，因此吸附能力略低于其他3 種樹脂。但從解吸效果來看，AB-8型樹脂對多酚的解吸率最高，達(dá)到71%，能夠較容易地解吸下來；D101型樹脂的解吸率最低，為56.58%。用于純化的樹脂不但應(yīng)具有較強(qiáng)的吸附能力，還應(yīng)該易于解吸，因此綜合考慮吸附率和解吸率，放棄D101型樹脂，選取另外3 種型號的樹脂進(jìn)一步實驗。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大孔樹脂動態(tài)洗脫的影響

依據(jù)相似相溶原理，與洗脫溶劑的極性越相似，多酚越易于洗脫。理想的洗脫溶劑應(yīng)使多酚具有較高的解吸率。由圖6可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，ADS-8型樹脂動態(tài)洗脫解吸率先升高后下降，且乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時，ADS-8型樹脂對龍眼核多酚的解吸率最高，為46%；D3520型樹脂動態(tài)洗脫解吸率呈先升后降的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時，解吸率高達(dá)78%，遠(yuǎn)優(yōu)于ADS-8型樹脂的解吸效果；乙醇體積分?jǐn)?shù)對AB-8型樹脂動態(tài)洗脫的影響與ADS-8型樹脂結(jié)果類似，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時，樹脂對多酚的解吸能力最強(qiáng)，解吸速率最快；體積分?jǐn)?shù)大于30%之后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，解吸率呈快速下降的趨勢。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對ADS-8、D3520、AB-8型樹脂解吸率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on the desorption rates of three macroporous adsorption resins

綜上所述，乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～40%時大孔樹脂對龍眼核多酚的解吸能力最強(qiáng)，這與前文結(jié)果一致，說明龍眼核多酚主要為水溶性的強(qiáng)極性物質(zhì)。而D3520型大孔樹脂在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時解吸率高達(dá)78%，遠(yuǎn)高于其他類型樹脂的解吸強(qiáng)度，因此選用D3520型大孔樹脂作為龍眼核多酚分離純化的理想樹脂。

2.4 FT-ICR-MS對龍眼核多酚結(jié)構(gòu)的表征

圖7 龍眼核多酚的FT-ICR-MS圖Fig.7 FT-ICR-MS of longan seed phenols

FT-ICR-MS是一種具有超高分辨能力、高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高 掃描速率的分析方法［19］。圖7為經(jīng)D3520樹脂純化后的龍眼核多酚的FT-ICR-MS譜圖。從圖7可以看出，龍眼核多酚的主要譜峰分布在m/z 100～700區(qū)間，負(fù)離子模式下檢測出9 個高分辨信號，其中在m/z 300.999 1和m/z 469.062 4條件下分別觀察到兩種豐度很高的物質(zhì)。通過高分辨信號推導(dǎo)、標(biāo)準(zhǔn)品參照和對比前期工作成果［20］，初步確認(rèn)m/z 300.999 1為鞣花酸的［M—H］-準(zhǔn)分子離子峰，與理論值相差0.007 2 u；m/z 469.062 4為（S）-flavogallonic acid的［M—H］-準(zhǔn)分子離子峰，與理論值相差0.050 3 u。此外，F(xiàn)T-ICR-MS還檢測到4種已知的多酚類物質(zhì)，分別為沒食子酸（m/z 169. 014 5）、沒食子酸乙酯（m/z 197.046 0）、楊梅素（m/z 319.047 1）、鞣花酸4-O-α- L-阿糖腺苷（m/z 433.042 2）、柯里拉京（m/z 633.072 6）。FT-ICR-MS對龍眼核多酚結(jié)構(gòu)的表征提示，龍眼核多酚主要含以鞣花酸及其衍生物為主的小分子質(zhì)量水解單寧。

2.5 單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定

由FT-ICR-MS分析結(jié)果可知，鞣花酸和（S）-flavogallonic acid在龍眼核多 酚中含量相對較高，利用半制備色譜法分離得到兩個單體化合物，并采用核磁共振、紫外光譜法及紅外光譜法進(jìn)一步確證二者的結(jié)構(gòu)。鞣花酸（化合物1）和（S）-flavogallonic acid（化合物2）的核磁共振結(jié)果如下：化合物1為黃色粉末，1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.52（2H，s，H-5，H-5’），5.35（2H，s，3-OH，3’-OH），5.35（2H，s，4-OH，4’-OH）；13C-NMR（125MHz，DMSO-d6）：δ107.54（C-1，C-1’），136.89（C-2，C-2’），140.10（C-3，C-3’），147.53（C-4，C-4’），110.82（C-5，C-5’），114.3（C-6，C-6’），159.23（C-7，C-7’）。該結(jié)果與文獻(xiàn)［21-23］一致?；衔?為黃色粉末，1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ7.53（H，s，H-5’），5.32（2 H，s，3-OH，3’-OH），5.32（2H，s，4-OH，4’-OH），5.29（3 H，s，3”-OH，4”-OH，5”-OH），7.17（1 H，s，H-6”）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δ114.91（C-1），135.91（C-2），138.14（C-3），146.11（C-4），126.45（C-5），109.45（C-6），158.58（C-7），113.65（C-1’），137.17（C-2’），139.39（C-3’），148.04（C-4’），112.28（C-5’），110.45（C-6’），158.95（C-7’），124.79（C-1”），116.74（C-2”），144.40（C-3”），137.39（C-4”），145.04（C-5”），108.32（C-6”），168.18（C-7”）。該結(jié)果與文獻(xiàn)［24］相符。

圖8 鞣花酸（a）與（S）-flavogalloonniicc acid（b）的紫外光譜圖Fig.8 UV spectra of ellagic acid （a） and （S）-flavogallonic acid （b）

圖8 分別為鞣花酸和（S）-flavogallonic acid的紫外吸收光譜。由圖8a可知，鞣花酸在255、360 nm波長處有最大吸收峰。其中255 nm波長處的高強(qiáng)度吸收說明結(jié)構(gòu)中含苯環(huán)，360 nm波長處的中強(qiáng)度吸收說明結(jié)構(gòu)中具有較大的共軛體系。由圖8b可知，（S）-flavogallonic acid在222、260、348 nm波長處有最大吸收峰。波長222 nm處的吸收說明由于沒食子酸取代基的引入，鞣花酸苯環(huán)上—OH的吸電子效應(yīng)使波長有較大幅度的紫移；波長260 nm處的高強(qiáng)度吸收說明隨著苯環(huán)數(shù)目增加，波長紅移；波長348 nm處的吸收說明取代基的引入使得共軛體系強(qiáng)度降低，波長向短波方向移動，吸收強(qiáng)度減弱。此結(jié)果與文獻(xiàn)［7］相符。

圖9 鞣花酸（a）與（S）-flavogallonic acid（b）的紅外光 譜圖Fig.9 IR spectra of ellagic acid （a） and （S）-flavogallonic acid （b）

圖9 分別為鞣花酸和（S）-flavogallo nic acid的紅外吸收光譜。由圖9a可知，鞣花酸在3 519、1 731、1 612、1 503、1 446、1 379、1 320、1 256、1 182、1 110、1 054、921、876、759 cm-1的位置有吸收峰。其中3 519 cm-1為O—H伸縮振動頻率，1 731 cm-1為C=O的伸縮振動頻率，1 612、1 503、1 446 cm-1是苯的C=C伸縮振動峰。由圖9b可知，（S）-flavogallonic acid在3 388、1 716、1 612、1 495、1 445、1 346、1 187、1 104、1 046、920、875、756 cm-1的位置有吸收峰。其中3 388 cm-1為O—H伸縮振動頻率，1 716 cm-1為C=O的伸縮振動頻率，1 612、1 495、1 446 cm-1是苯的C=C伸縮振動峰，920 cm-1為羧基面外O—H的伸縮振動頻率。紅外譜圖分析結(jié)果與文獻(xiàn)［25］相符，各峰波數(shù)基本一致，重現(xiàn)性較好。核磁共振、紫外和紅外分析結(jié)果均與文獻(xiàn)［21-25］報道一致，由此確定了鞣花酸和（S）-flavogallonic acid的結(jié)構(gòu)。兩種單體化合物的分子結(jié)構(gòu)式如圖10所示。由圖10可知，（S）-flavogallonic acid屬于鞣花酸的衍生物。

圖10 龍眼核多酚單體化合物的分子結(jié)構(gòu)式Fig.10 Chemical structures of ellagic acid （a） and （S）-flavogallonic acid （b）

3 結(jié) 論

本實驗以來源豐富的龍眼核為原料，采用正交試驗法確定有機(jī)試劑提取龍眼核多酚的最佳工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間90 min。在此條件下，龍眼核多酚提取量為36.15 mg/g。極差分析發(fā)現(xiàn)，提取時間這一因素對多酚提取量的影響極為顯著。通過4 種樹脂對龍眼核多酚靜態(tài)吸附及解吸性能的比較，確定D3520型樹脂為龍眼核多酚分離純化的理想樹脂，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時，多酚的解吸率最高為78%。此外，采用FT-ICR-MS對龍眼核多酚結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果表明，龍眼核多酚主要成分為以鞣花酸及其衍生物為主的小分子質(zhì)量水解單寧。通過核磁共振、紫外光譜和紅外光譜對兩種豐度很高的物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果與文獻(xiàn)報道［7，21-25］基本一致，重現(xiàn)性較好。龍眼核多酚含量較豐富，多酚類化合物又具有多種生理活性功能，值得深入開發(fā)利用。

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Separation and Purification of Phenols from Longan （Dimocarpus longan Lour.） Seeds and Their Structural Analysis

CHEN Jinyu， ZENG Jian， LI Chunmei*
（College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Orthogonal array design was used to optimize the extraction conditions for phenols from longan （Dimocarpus longan Lour.） seeds by evaluating the effect of four crucial variables including alcohol concentration， solid-to-solvent ratio，extraction temperature and extraction time on the yield of phenols. The optimum conditions were determined as follows：ethanol concentration 40%， solid-to-solvent ratio 1：20 （g/mL）， extr a ction temperature 70 ℃， and extraction time 90 min. Under these conditions， the maximum yield of phenols of 36.15 mg/g was obtained. D3520 resin was selected to purify longan seed phenols by comparing static absorption and dynamic desorption capacity of four mac roporous resins， and 40% ethanol was chosen as the best elution solvent. The structural properties of longan seed phenols were preliminarily analyzed by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry （FT-ICR-MS）， and the results showed that longan seed phenols were mainly composed of hydrolyzable tannins with small molecular weights， such as ellagic acid and its derivatives. Ellagic acid and （S）-flavogal lonic acid wer e confirmed as two abundant compounds from lon gan seeds by NMR，UV spectroscopy and IR spectroscopy. （S）-Flavogallonic was identified as a derivative of ellagic acid.

longan seeds； phenols； separation and purification； structural analysis；

TS201.1

A

1002-6630（2015）16-0031-07

10.7506/spkx1002-6630-201516006

2014-11-18

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B03）

陳金玉（1988—），女，博士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：fish198803@126.com

*通信作者：李春美（1973—），女，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：lichmyl@mail.hzau.edu.cn

Fourier transform ion cyclotron reson ance mass spectrometry （FT-ICR-MS）