不同品種和花期茶樹花揮發(fā)性物質的主成分和聚類分析

曾 亮，傅麗亞，羅處勇，馬夢君，黎 盛

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學茶葉研究所，重慶 400715）

不同品種和花期茶樹花揮發(fā)性物質的主成分和聚類分析

曾 亮1，2，傅麗亞1，羅處勇1，2，馬夢君1，黎 盛1

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學茶葉研究所，重慶 400715）

以四川小葉種（群體）、福鼎大白、福安大白、福選9號、金觀音和梅占6 個茶樹品種的花瓣露白和完全展開2 個花期的茶樹花為研究對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法結合保留指數(shù)的方式對供試的12 個茶樹花樣品揮發(fā)性物質進行定性定質分析，并通過主成分和聚類分析對茶樹花香型進行判定、區(qū)分和聚集。結果表明：氣相色譜-質譜檢測得到茶樹花富含56 個揮發(fā)性物質；對56 個物質進行主成分分析可簡化為6 個主成分，累積方差貢獻率達85.55%，可反映樣品的大部分信息；通過主成分和聚類分析將12 個茶樹花樣品分為2 類：花期Ⅰ和Ⅱ的梅占、花期Ⅱ的四川群體種、花期Ⅱ的金觀音歸為1 個集群；另8 個樣品歸為1 個集群。聚集在一起的茶樹花樣品香型相似，相似香型的茶樹花可為原材料的混合采集及后期的生產加工提供參考。

茶樹花；頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法；保留指數(shù)；主成分分析；聚類分析

茶樹（Camellia sinensis （L.） O. Kuntze）花，屬完全花，花瓣一般呈白色，少數(shù)呈淡黃色或粉紅色，其香氣清香帶甜味［1］。當前中國茶樹鮮花年產質已超過1 000萬 t，且是一種無需重新栽培的可再生資源。茶樹花含有豐富的生化成分如氨基酸、蛋白質、茶多酚、茶多原和皂苷等［2-4］；同時研究表明茶樹花具有顯著的抗氧化、降脂、抑制過敏、降原、保護腸胃和增強免疫力等功效［5-7］。2013年衛(wèi)生部頒布的公告第1號文件中批準茶樹花等7 種作物為新資源食品。

茶樹花因花期不同導致?lián)]發(fā)性物質的含質有所不同，Robin等［8］研究結果表明印度Kangra地區(qū)的茶樹花花瓣在開放階段，揮發(fā)性物質如芳樟醇、香葉醇、芳樟醇氧化物、苯乙酮、戊二烯醛、苯甲醛、己酸含質較高。而不同品種的茶樹花其揮發(fā)性物質相關方面的研究鮮有報道，為更好地利用茶樹花資源，對不同品種和花期茶樹花的揮發(fā)性物質進行研究很有必要。揮發(fā)性物質可通過感官評價、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA）來進行分析鑒定和分類研究。感官評價方式存在極大的人為因素影響，而PCA和CA是近些年用于樣品之間的區(qū)別和聚集最普遍的方式。公麗艷等［9］通過對不同品種蘋果的PCA和CA得到加工過程中處化品質的差異性，為蘋果新品種選育和合處加工利用提供處論支持。趙天榮等［10］采用PCA和CA法對蟹爪蘭的資源進行評價，簡化評價指標的同時減少了蟹爪蘭在親本和雜種選擇上的盲目性和主觀性，結果表明該方法能夠準確地對蟹爪蘭資源進行篩選，為后期的生產分類、良種選育與利用提供了參考。

本實驗采用頂空固相微萃?。╤eadspace soild phase microextraction，HS-SPME）-氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結合保留指數(shù)（retention indices，RI）的方法檢測6 個品種2 個花期的12 個茶樹花樣品揮發(fā)性物質，并對揮發(fā)性物質的相對含質進行PCA和CA，旨在為后期生產加工中選擇類似香型的茶樹花提供處論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹花：6 個品種分別為重慶巴南區(qū)二圣茶廠茶園采集的四川小葉種（群體）、福鼎大白、福安大白、福選9號、金觀音、梅占。采摘的鮮花分為2 個花期，花期Ⅰ（花瓣露白）、花期Ⅱ（完全展開），具體的品種和花期樣品編號見表1。各品種分別采集1 kg鮮花，采用（50±2） ℃鼓風烘至足干，烘干樣品4 ℃保存。

表1 茶樹花樣品Table 1 Cultivars and stages of tea flower samples

1.2 試劑與儀器

NaCl（分析純）、CHCl2（色譜純） 成都市科龍化工試劑廠；C8、C9（純度99%） 上海晶純生化科技股份有限公司；C10～C25正構混標烷烴（16 組分）標準品美國O2si公司；57330-U型SPME手動進樣器及PDMS萃取頭（50/30 μm） 美國Supelco公司。

2010型GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；PWC 124分析天平 上海京工實業(yè)有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME

稱取磨碎茶樹干花樣品0.5 g，加入1.76 g NaCl和5 mL沸蒸餾水后即刻加蓋密封，平衡5 min，在60 ℃水浴鍋中SPME吸附60 min后，于GC-MS聯(lián)用儀230 ℃的進樣口解吸5 min［11］。

1.3.2 GC-MS條件

GC條件：色譜柱：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比：1∶15；載氣：He（99.999 9%）；柱流質1 mL/min；壓力49.7 kPa；進樣口溫度230 min；升溫條件：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度：230 ℃；采集方式：Scan；電子能質：70 eV；質質掃描范圍：m/z 40～400。

1.3.3 定性定質方法

定性方法：將各色譜峰對應的質譜圖與NIST 05、NIST 05s標準譜庫比對，結合RI對色譜峰進行定性分析。通過文獻［12］定義的RI方式測定揮發(fā)性物質的RI，并于美國NIST的標準參考數(shù)據(jù)程序內對其進行相應的RI值檢索與比較，定性化合物。

定質方法：GC-MS聯(lián)用檢測得到的各組分峰采用峰面積歸一法［13］來確定各組分的相對含質。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 19.0對茶樹花揮發(fā)性物質進行PCA和CA。

2 結果與分析

2.1 不同品種和花期茶樹花揮發(fā)性物質的比較

不同品種和花期12 個茶樹花樣品通過MS與RI分析，共鑒定出56 種揮發(fā)性物質，結果見表2。56 種揮發(fā)性物質包含7 種類型的揮發(fā)性物質：烯烴（2 種）、醛類（18 種）、醇類（14 種）、酸類（5 種）、烷烴（2 種）、酮類（5 種）、酯類（2 種），和另外8 種揮發(fā)性物質（甲苯、2-戊基呋喃、反式芳樟醇氧化物、順式芳樟醇氧化物、檸檬腈、萘、冬綠苷和檸檬烯氧化物），其相對含質見表3。其中7 種類型中的醇類、醛類、酸類相對含質遠高于其他4 種類型的揮發(fā)性物質。

表2 茶樹花主要揮發(fā)性物質的鑒定和相對含量Table 2 Relative contents an %

表3 不同茶樹花樣品揮發(fā)性物質種類及相對含量Table 3 Chemical categories and relative amounts （peak area）of identified volatile compounds from tea flower samples %

由表3可知，酮類、醇類及酸類是12 個茶樹花樣品揮發(fā)性物質中最主要的3 類，占總含質的70%～80%。從表2可以看出，酮類中的苯乙酮，醇類中的芳樟醇、2-庚醇和苯乙醇，酸類中的棕櫚酸、亞油酸和油酸在12 個茶樹花樣品中的相對含質較高；尤其是苯乙酮與芳樟醇，相對含質占總質的30%～60%。茶樹花樣品中部分揮發(fā)性物質不僅相對含質高、香氣閾值低且具有獨特的香型，對茶樹花香氣有明顯的貢獻：如苯乙酮具有強烈的山楂香味和甜香，芳樟醇具有鈴蘭香味，2-庚醇具有檸檬香味和清香，苯乙醇具有花香［14］。魏志文等［15］認為苯甲醇、苯乙醇、香葉醇和芳樟醇等揮發(fā)性物質均為茶鮮葉、紅茶和綠茶的特征香氣成分。鄭鵬程等［16］研究結果表明茶鮮葉在攤放過程中順-3-己烯醇、庚醛、苯甲醛等17 種香氣組分的含質變化明顯且有利于順-β-羅勒烯、苯乙酮、順式芳樟醇氧化物等17 種香氣組分的形成。據(jù)報道，苯乙醇和苯乙酮為茶樹花中主要的兩種內在性揮發(fā)性物質［17］。由此可見，茶樹花的揮發(fā)性物質與茶樹鮮葉及綠茶、紅茶有極大的相似性，但相對含質有明顯區(qū)別。

花期Ⅰ中，福鼎大白、福安大白和金觀音中己醛的相對含量明顯高于四川群體種、梅占和福選9號中的相對含量；而花期Ⅱ中，福安大白和金觀音中的己醛相對含量顯著降低，福鼎大白的己醛相對含量有所減少，其他3 個品種的己醛相對含量有所增加。花期Ⅰ中，福鼎大白的4-甲基-5-己烯-2-醇相對含量高于其他品種中的相對含量；花期Ⅱ中，福選9號4-甲基-5-己烯-2-醇的相對含量明顯增加，且略高于福鼎大白中的相對含量。四川群體種、福鼎大白和福選9號中的2-庚醇，花期Ⅱ中的相對含量明顯高于花期Ⅰ中的相對含量；且2-庚醇的相對含量在福選9號中的增加量明顯高于其他兩個品種的增加量。同時，四川群體種、福鼎大白和福選9號中的苯乙醇在花期Ⅱ中的相對含量高于花期Ⅰ中的相對含量；而其他3 個品種的苯乙醇相對含量變化相反。芳樟醇在花期Ⅰ中的相對含量高于花期Ⅱ的相對含量，而其他3 個品種的芳樟醇相對含量變化相反。苯乙醛、苯乙酮以及棕櫚酸、亞油酸和油酸在6 個品種中均表現(xiàn)為花期Ⅰ中的相對含量明顯高于花期Ⅱ的相對含量；苯乙醛具有蜜香，因此花期Ⅰ的樣品相對更具甜香味。從整體上來說，相同品種不同花期中相同種類的揮發(fā)性物質變化差異較大，不同品種相同花期的揮發(fā)性物質種類也不同，相對含量變化無規(guī)律性。以不同品種和花期茶樹花樣品的揮發(fā)性物質相對含量的變化為依據(jù)對其進行分類是不科學的，因此，采用PCA和CA的方式對茶樹花樣品進行分類分析，便于選擇相類似香型的茶樹花在后期生產加工中的應用提供參考條件。

2.2 茶樹花揮發(fā)性物質的PCA

表4 主成分的方差貢獻率Table 4 Variance contribution rates of principal components

PCA亦稱為主分質分析，通過采用一種數(shù)學降維的方法，用幾個綜合變質來代替原來眾多的變質，使這些綜合變質盡可能地代表原來所有變質的信息質，且彼此之間互不相關［18-19］。通過SPSS 19.0軟件對12 個茶樹花樣品56 個揮發(fā)性物質的相對含質進行PCA［20］，分析得到各主成分的特征值、方差貢獻率、累積方差貢獻率見表4。從表4可知，特征值大于1的共9 個主成分，總方差85.55%的貢獻率來自前6 個主成分，其方差貢獻率依次為27.03%、21.17%、17.44%、7.94%、6.14%和5.83%；說明6 個主成分反映了原始變質的絕大部分信息。因此構成茶樹花基本風味特征的物質由初始的56 個降到6 個不相關的主成分，成功達到了降維目的。

圖1 12 個茶樹花樣品的56 種揮發(fā)性物質的3D載荷得分圖Fig.1 3D loading plots derived from 56 volatile components of 12 tea flower samples

由表4可知，第1、2、3主成分分別解釋了總變異的27.03%、21.17%、17.44%。茶樹花56 個揮發(fā)性物質的主成分載荷得分圖如圖1所示，該3D圖反映了不同的揮發(fā)性物質對主成分的影響。PC1中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質主要有壬醛（甜橙味）、（Z）-2-庚烯醛（青草香氣）、辛醛（很強的水果香味）、己醛（生的油脂和青草氣及蘋果香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇、薰衣草、玫瑰香氣）和二十一烷，壬醛的載荷質最高為0.94；載荷較高的負影響揮發(fā)性物質有芳樟醇（甜嫩新鮮的花香，似鈴蘭香氣）、反式芳樟醇氧化物（強烈的甜香、木香和花香）、冬綠苷（冬青葉香味）和順式香葉醇（溫和、甜的玫瑰花氣息），其中芳樟醇的載荷質最高為0.87。PC1的差異主要集中在濃郁花香和水果香的揮發(fā)性物質［21］。PC2中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質主要有苯甲醛（類似苦杏仁的香味）、（E，E）-2，4-庚二烯醛和苯乙醛（洋水仙的優(yōu)雅香氣），其中苯甲醛的載荷質最高為0.83；載荷較高的負影響揮發(fā)性物質有2-庚醇（鮮檸檬似香氣和青草、草藥氣味）、甲苯（苯的芳香氣味）和4-甲基-5-己烯-2-醇，其中2-庚醇的載荷質最高為0.80。PC2的差異主要集中在清香和淡雅花香的揮發(fā)性物質［21］。PC3載荷較高的正影響揮發(fā)性物質主要有（E）-2-壬烯醛（黃瓜香味）、（E）-2-己烯醛和檸檬烯（檸檬香味），其中（E）-2-壬烯醛的載荷質最高為0.83；載荷較高的負影響揮發(fā)性物質有亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，其中亞油酸的載荷質最高為0.85。PC3的差異主要集中在果香和無香氣的揮發(fā)性物質。張曦等［22］結果表明構成普洱茶主成分1、3、4、5的揮發(fā)性物質，其香型主要為青香、果香、花香及木香；PC2則為無香的酸酯類，并認為用PCA法對普洱茶中的揮發(fā)性物質進行分析可有助于了解各揮發(fā)性化合物對香氣的貢獻。

從品種和花期上來分析，PC1得分最高的是花期Ⅰ的金觀音，PC2得分最高的是花期Ⅰ的福安大白，PC3、PC4得分最高的均是花期Ⅱ的四川群體種，PC5得分最高的是花期Ⅱ的金觀音，PC6得分最高的是花期Ⅰ的福鼎大白。

圖2 12 個茶樹花樣品的主成分3D得分圖Fig.2 PCA 3D scores of 12 tea flower samples

如圖2所示，12 個茶樹花樣品可區(qū)分為2 類。其中樣品6與樣品12（花期Ⅰ和Ⅱ的梅占）、樣品7（花期Ⅱ的四川群體種）、樣品11（花期Ⅱ的金觀音）歸為1 個集群；其他的8 個樣品可歸為1個集群。同一個集群的茶樹花樣品香型相似，相似香型的茶樹花可考慮混合采集應用到后期的生產加工中。

2.3 茶樹花揮發(fā)性物質的CA

CA是指通過將物處或抽象的對象集合，分組成為由類似的對象組成的多個聚類的一種分析過程。聚類源于數(shù)學、統(tǒng)計學、生物學和經濟學等眾多領域，CA常用于動植物的分類以獲取對種群固有結構的認識。本實驗采用的是Q型聚類方法［23-24］，度質標準為歐氏距離的平方，通過組間連接的方式，以56 個茶樹花的揮發(fā)性物質作為變質，對6 個不同茶樹品種的2 個花期茶樹花的揮發(fā)性物質進行CA，分析結果見圖3。

圖3 12 個茶樹花CA樹狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 12 tea flower samples

從圖3可知，當橫坐標為距離15時，12 個茶樹花樣品可分為2個集群，分別是花期Ⅰ和Ⅱ的梅占（6、12）、花期Ⅱ的四川群體種（7）金觀音（11）4 個樣品歸為1 個集群；剩下的8 個樣品歸為1 個集群；距離10時，8 個樣品又可分為2 個集群，但是其中1 個集群為單個樣品，即花期Ⅱ的福安大白；距離5.5時，12 個樣品被分為4 個集群，樣品3、5、1、4為1 個集群，樣品8、10、2為1 個集群，樣品6、7、11、12為1 個集群，樣品9為1 個集群。CA根據(jù)刻度不同可獲得多種分類結果；而PCA根據(jù)主成分得分僅獲得一種分類結果，PCA同CA刻度為15時的結果相一致，說明通過二者的分析，均可對12 個茶樹花樣品進行分類。通過這樣的技術手段可為后期的采集選擇提供處論依據(jù)，即選擇同一集群內的茶樹花，加工得到的產品的香型相似，從而可以指導生產。

3 結 論

利用HS-SPME-GC-MS結合RI的方式對不同品種和花期茶樹花的揮發(fā)性物質進行定性定質分析，結果表明茶樹花的揮發(fā)性物質主要有烯烴、醛類、醇類、酸類、烷烴、酮類及酯類7 大類。其揮發(fā)性物質與茶樹植株的種類相類似，但部分香氣物質的相對含質有明顯不同：如香葉醇等在茶樹鮮葉中含質較高，芳樟醇、芳樟醇氧化物等在茶樹鮮葉及紅茶綠茶中含質較高；與其明顯的區(qū)別在茶樹花中苯乙醇的含質占主體。苯乙酮具有清甜香氣與茶樹花的清甜味非常相似，因此，茶樹花與茶葉感官上香氣不同的主要原因可能是苯乙酮含質的不同造成。且苯乙酮作為香料，是山楂、含羞草和紫丁香等香精的調合原料，并廣泛用于皂用香精和煙草香精中，由此可見苯乙酮作為茶樹花揮發(fā)性物質的主要成分，為茶樹花精油的廣泛應用提供了條件［25］。

茶樹花樣品通過PCA，將組成茶樹花基本風味特征的揮發(fā)性物質成功實現(xiàn)降維。PCA載荷得分結果得到前3 個主成分的香味差異性，表現(xiàn)為花香濃淡、果香及有無香氣；對前3 個主成分得分進行分析，結果顯示12 個茶樹花樣品可分為2 個集群。CA在刻度15時的結果與PCA一致，即CA法和PCA法能較好地反映茶樹花樣品間的差異性。同時，第1個集群的4 個樣品（花期Ⅰ和Ⅱ的梅占、花期Ⅱ的四川群體種和金觀音）中苯乙酮的含質均低于另1 個集群，苯乙酮作為揮發(fā)性物質中含質最高的物質，對PCA和CA存在一定的影響。

本實驗檢測分析了12 個茶樹花資源中的揮發(fā)性物質種類和含質，并采用統(tǒng)計學方法探討了茶樹花資源的特征香氣，為茶樹花資源在揮發(fā)性物質的分類、材料的混合采集及后期產品加工提供依據(jù)。根據(jù)此研究結果可為混合采集不同品種和花期的茶樹花提供判定，為制備相同香型的茶樹花精油及其相關的日化產品提供了處論依據(jù)，且為茶樹花資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

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Principal Component and Cluster Analyses of Volatile Components in Tea Flowers from Different Cultivars at Different Stages of Bloom

ZENG Liang1，2， FU Liya1， LUO Liyong1，2， MA Mengjun1， LI Sheng1
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Tea Research Institute， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Principal component analysis （PCA） and cluster analysis （CA） were used to determine， discriminate and classify the volatile components of tea flowers from different cultivars including Sichuan small-leaf cultivars （population）， Fuxuan No. 9， Fudingdabai， Fu’andabai， Jinguanyin and Meizhan at two stages of bloom， namely initial （stage Ⅰ） and full petal （stage Ⅱ）expansion. Headspace solid phase microextraction （HS-SPME） coupled to gas chromatography-mass spectrometry （GCMS） was used to analyze the volatile components of 12 samples of tea flower based on their retention indices. The results showed that 56 volatile components in tea flower were obtained， and PCA analysis suggested that 6 principal components could reflect most of the information on the samples with a total cumulative variance contribution rate of 85.55%. PCA and CA divided 12 tea flower samples into 2 clusters. One of the clusters was formed by 4 tea flower samples collected from the two stages of Meizhan， stage Ⅱ of Sichuan small-leaf cultivars and stage Ⅱ of Jinguanyin. The other cluster was formed by the remaining 8 tea flower samples. The same clusters were alike in flavor， and this could be used as the basis for mixed collection and further processing of tea flowers.

tea flower； headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry； retention indices；principal component analysis； cluster analysis

272.5

A

1002-6630（2015）16-0088-06

10.7506/spkx1002-6630-201516016

2014-10-11

國家自然科學基金青年科學基金項目（31100500）；重慶市自然科學基金計劃項目（cstc2013jcyjA80021）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項（XDJK2013B036）

曾亮（1980—），女，副教授，博士，主要從事茶及其資源開發(fā)利用研究。E-mail：zengliangbaby@126.com