山銀花綠原酸提取方法的比較

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中草藥與天然產(chǎn)物研究室，湖南長(zhǎng)沙410128）

山銀花為常用中藥，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效［1］，同時(shí)山銀花還是重要的化工原料和優(yōu)良飲品原料［2］。山銀花分布廣，在我國(guó)西南、中南地區(qū)有大量栽培［3－5］。湖南邵陽、婁底、懷化等地區(qū)的山銀花藥材商品名為“湘銀花”，其產(chǎn)量占全國(guó)山銀花總產(chǎn)量的40%以上。

作者在此分別采用水提法、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法提取山銀花中的綠原酸，并通過高效液相色譜測(cè)定綠原酸含量，比較各種方法的提取效果，以期為植物有效成分的提取提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

山銀花，湖南省隆回縣小沙江鎮(zhèn)金銀花基地；纖維素酶；綠原酸。

無水乙醇、甲醇、磷酸等均為分析純；乙腈為色譜純；蒸餾水。

KQ3200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；THZ－92B 型臺(tái)式恒溫振蕩器，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；DK－S24型恒溫水箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；AL204型電子天平，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；SHZ－D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義英峪予華儀器廠；R－1001N 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；1200型高分離度快速液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山銀花中綠原酸的提取

1）水提法

將山銀花莖于60 ℃恒溫干燥后用中草藥粉碎機(jī)粉碎。精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中，分別用10 倍量、10 倍量、8 倍量的蒸餾水于70 ℃煎煮3次，每次1h。合并煎煮液，抽濾，取濾液于60℃減壓濃縮至干，置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得綠原酸粗提物。

2）醇提法

精確稱取5g干燥的山銀花粉末于250mL 圓底燒瓶中，加75%乙醇，分別用10 倍量的75%乙醇于80 ℃下加熱回流提取2次，每次1h。合并提取液，抽濾，取濾液于60 ℃減壓濃縮至干，置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得綠原酸粗提物。

3）酶解法

精確稱取0.5g纖維素酶（2 000IU·g－1）定容于100mL容量瓶中配制成0.5%纖維素酶液。精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100 mL 錐形瓶中，加入10倍量0.5%纖維素酶液處理15 min，迅速高溫滅活，將處理液分別用10倍量60%乙醇和10倍量蒸餾水于80℃加熱回流提取2次，每次1h。合并提取液，抽濾，取濾液于60 ℃減壓濃縮至干，置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得綠原酸粗提物。

4）超聲波法

精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中，加入12 倍量蒸餾水，在超聲波清洗器中處理0.5h，再分別用10倍量、10倍量、8倍量的蒸餾水于70 ℃煎煮3次，每次1h。合并煎煮液，抽濾，取濾液于60℃減壓濃縮至干，置于恒溫干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得綠原酸粗提物。

5）微波法

精確稱取5g干燥的山銀花粉末于100mL 錐形瓶中，先用少量乙醇潤(rùn)濕，再加入1.25倍量的75%乙醇，用微波快速汽化處理70s后，用25倍量的90 ℃水洗滌10min，再用水提法提取得綠原酸粗提物。

1.2.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜（圖1）

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜Fig.1 The HPLC of chlorogenic acid standard

HPLC 條件：流動(dòng)相為乙腈－0.4%磷酸（23∶77，體積比），流速為1mL·min－1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)324nm，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

1.2.3 綠原酸提取率的測(cè)定

將綠原酸粗提物置于50mL容量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻；再稀釋50 倍，用50%甲醇定容，搖勻；0.45μm 濾膜過濾，備用。用流動(dòng)相將柱子洗脫干凈后，進(jìn)樣5μL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。取待測(cè)樣品5 μL進(jìn)樣，測(cè)得各樣品的峰面積。根據(jù)標(biāo)樣濃度以及樣品峰和標(biāo)樣峰的面積比可求得各提取液中綠原酸含量，按下式計(jì)算綠原酸提取率：

2 結(jié)果與討論

2.1 提取效果比較

采用5種方法提取山銀花中的綠原酸，比較各方法所得綠原酸含量和提取率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提高山銀花中綠原酸提取率，其中微波法提取率最高，醇提法提取率最低。具體比較如下：

（1）水提法提取率為4.51%，醇提法提取率為3.14%，水提法提取率明顯高于醇提法，且相對(duì)于醇提法，水提法藥品消耗量少、步驟簡(jiǎn)單。這是因?yàn)?，綠原酸的水溶性好，易溶于熱水，在25 ℃水中的溶解度約為4%，故水提法提取率高于醇提法。

圖2 不同方法所得綠原酸含量（a）和提取率（b）比較Fig.2 Comparison of content（a）and extraction rate（b）of chlorogenic acid by different methods

（2）醇提法和酶解法均是在80℃下用乙醇加熱回流提取2次，醇提法提取率為3.14%，酶解法提取率為4.14%，酶解法提取率明顯高于醇提法。這是因?yàn)?，山銀花用纖維素酶處理后，細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)致密的纖維素水解成水溶性糖類物質(zhì)，有利于胞內(nèi)物質(zhì)（綠原酸）溶出，綠原酸提取率相應(yīng)提高。如能控制好酶處理溫度及作用時(shí)間則能大幅提高山銀花中綠原酸提取率。酶解法操作簡(jiǎn)便、提取物純度高、無有機(jī)溶劑殘留，但生產(chǎn)成本較高，其可行性有待進(jìn)一步研究。

（3）超聲波法提取率為4.62%。超聲波能擊碎細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)組分滲透到溶液中，從而達(dá)到分離的目的。該法提取率高、綜合成本低、污染小、易過濾，無醇提法中因溶劑使用帶來的不利。但山銀花經(jīng)超聲波處理后呈糊狀黏稠，不利于后續(xù)操作，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，其可行性有待進(jìn)一步研究。

（4）微波法提取率為4.69%。與超聲波法相比，微波法不僅提取率高、提取時(shí)間短，且重復(fù)性好，可用于植物有效成分的快速分析，但操作步驟繁瑣，不適宜大量樣品的處理。

2.2 方差分析（表1，表2）

表1 5種方法提取率的描述性指標(biāo)Tab.1 The descriptive index of extraction rate by five methods

表2 5種方法提取率的兩兩比較（LSD法）Tab.2 The binary comparison of extraction rate by five methods（LSD method）

由表2可知，以LSD 法作均數(shù)進(jìn)行兩兩比較的結(jié)果為：水提法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異（具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；醇提法與水提法、酶解法、超聲波法、微波法之間存在顯著性差異；酶解法與水提法、醇提法、超聲波法、微波法之間存在顯著性差異；超聲波法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異；微波法與醇提法、酶解法之間存在顯著性差異。

2.3 討論

（1）酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提高山銀花中綠原酸提取率，其中提取率最高的是微波法，酶解法和超聲波法也能得到較高的提取率，但只適合提取少量樣品，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，其可行性有待進(jìn)一步研究。

（2）綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，高溫加熱易氧化分解，因此，高溫及長(zhǎng)時(shí)間加熱不利于山銀花中綠原酸的提取。在堿性條件下，綠原酸可發(fā)生水解，在提取純化時(shí)也應(yīng)予以注意。綠原酸分子中含有5個(gè)羥基和1個(gè)羧基，在水中溶解度達(dá)4%，因此，從經(jīng)濟(jì)、適用和安全角度出發(fā)，大量提取山銀花中綠原酸時(shí)，多以水為溶劑。

3 結(jié)論

分別采用水提法、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法提取山銀花中綠原酸，提取率大小依次為：微波法（4.69%）＞超聲波法（4.62%）＞水提法（4.51%）＞酶解法（4.14%）＞醇提法（3.14%）。可以看出：水提法、醇提法、酶解法、超聲波法、微波法均能不同程度提取山銀花中綠原酸，其中微波法提取率最高，醇提法提取率最低。

［1］張英華，陳新，張國(guó)飛，等.芪冬頤心口服液中綠原酸的含量測(cè)定［J］.長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，14（3）：52.

［2］張華年，楊少芳，陳繼業(yè)，等.HPLC 同時(shí)測(cè)定雙黃連注射液中綠原酸和黃芩苷2種指標(biāo)成分含量［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1999，16（6）：47－49.

［3］周日寶，賀又舜，羅躍龍.湖南省大宗道地藥材的資源概況［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2003，5（2）：71－74.

［4］茍占平，萬德光.四川忍冬屬藥用植物資源調(diào)查［J］.華西藥學(xué)雜志，2005，20（6）：480－482.

［5］茍占平，萬德光.重慶忍冬屬藥用植物資源研究［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，27（4）：10－11.