溫補(bǔ)腎陽(yáng)法對(duì)腎陽(yáng)虛肺纖維化大鼠肺內(nèi)CTGF表達(dá)的影響

趙敏徐安莉周艷艷陳會(huì)敏黃陳偉

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430061)

摘要〔〕目的探討溫補(bǔ)腎陽(yáng)法治療腎陽(yáng)虛肺纖維化(PF)的作用及機(jī)制。方法60只雄性6周齡Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和干預(yù)組，采用一次性博來(lái)霉素A5氣管插管給藥加腺嘌呤連續(xù)灌胃28 d復(fù)制腎陽(yáng)虛P(yáng)F大鼠模型。正常組大鼠氣管插管給予生理鹽水加等滲生理鹽水灌胃作為對(duì)照，模型組大鼠造模后生理鹽水灌胃14 d，干預(yù)組大鼠造模后加味參附湯灌胃14 d，每組于實(shí)驗(yàn)第42天處死大鼠，留24 h尿液檢測(cè)17-羥皮質(zhì)類(lèi)固醇(17-OH-CS)含量，同時(shí)，HE和MASSON染色觀察肺纖維化程度，免疫組化法和Western印跡測(cè)定大鼠肺內(nèi)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)肺組織CTGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，腎陽(yáng)虛肺纖維化模型大鼠尿17-OH-CS明顯下降，模型大鼠肺組織內(nèi)可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)大量破壞，大量膠原沉積，干預(yù)組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)也基本消失，可見(jiàn)較多的膠原沉積，病理組織學(xué)表現(xiàn)明顯輕于模型組。與正常組比較，模型組肺組織CTGF在肺內(nèi)的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組大鼠肺內(nèi)CTGF的表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論腎陽(yáng)虛P(yáng)F大鼠腎陽(yáng)虛癥狀明顯，肺內(nèi)纖維化表現(xiàn)明顯，造模成功，加味參附湯可以改善大鼠腎陽(yáng)虛癥狀，可能通過(guò)抑制CTGF蛋白表達(dá)而緩解肺內(nèi)膠原的進(jìn)一步沉積減緩肺纖維化的發(fā)展。

關(guān)鍵詞〔〕腎陽(yáng)虛；肺纖維化；溫補(bǔ)腎陽(yáng)法；CTGF

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R563.9〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81202615)

The expression of CTGF in the lungs of rats with kidney yang deficiency of pulmonary fibrosis by warming and Tonifying Kidney Yang method

ZHAO Min,XU An-Li,ZHOU Yan-Yan,etal.

Hubei University of Chinese Medicine,Basic Medical College,Wuhan 430061,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the expression of CTGF in the lungs of rats with kidney yang deficiency of pulmonary fibrosis by warming and Tonifying Kidney Yang method. Methods60 6-week-old male Wistar rats were randomly divided into normal,model and intervention groups. The rats of normal and model groups were given saline irrigation stomach,the rats of intervention group were given modified Shenfu decoction for 14 d. The content of 17-hydroxyl cortex steroids(17-OHCS) of 24 h urine was measured,lung fiber was observed by HE and MASSON staining,the expressions of CTGF protein and mRNA in lung tissue were tested by Western blot and RT-PCR.ResultsCompared with that of control group,and the content of 17-OHCS in model group was lower,decreased alveolar structures of kidney-Yang deficiency model of pulmonary fibrosis rats were destroyed,a large number of collagen was deposited;alveolar structures in intervention group were also disappeared,more collagen was deposited,but the pathological histology changes were significantly lighter than those of model group. Compared with that of control group,the expression of CTGF in pulmonary tissue of model group was increased(P<0.05),and it was lower in intervention group than that in model group(P<0.05).ConclusionsModified Shenfu decoction could improve the symptoms of kidney yang deficiency rats,and inhibit the expression of CTGF,relief further deposition of collagen in lung, slow down the development of pulmonary fibrosis.

【Key words】Kidney-yang deficiency；Lung fibrosis；Warming and Tonifying Kidney Yang method;CTGF

第一作者：趙敏(1980-)，女，講師，博士在讀，主要從事五臟相關(guān)研究。

肺纖維化(PF)是多種肺系慢性疾病的共同結(jié)局，肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞增殖、膠原過(guò)度沉積、肺泡結(jié)構(gòu)遭破壞是其典型的病理學(xué)特點(diǎn)，研究顯示結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)可以介導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生，在肺纖維化中起關(guān)鍵作用〔1,2〕?；颊叱霈F(xiàn)肺纖維化的臨床癥狀往往已是肺系疾病的慢性遷延期，“絡(luò)虛不榮，虛實(shí)夾雜”為慢性遷延期病機(jī)特點(diǎn)，中醫(yī)治療認(rèn)為“大凡絡(luò)虛，通補(bǔ)最宜”，故通補(bǔ)兼施，寓通于補(bǔ)為肺纖維化慢性遷延期總的施治原則?！澳I為生氣之根，肺為生氣之主?！迸R床中醫(yī)治療特發(fā)性肺纖維化時(shí)，許多醫(yī)家都考慮到了腎主納氣、輔助呼吸的作用。本實(shí)驗(yàn)擬采用溫補(bǔ)腎肺、活血化痰的加味參附湯對(duì)腎陽(yáng)虛肺纖維化的模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)CTGF在肺內(nèi)的表達(dá)，確定溫補(bǔ)腎陽(yáng)在臨床中藥防治肺纖維化的作用效果及其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物健康Wistar大鼠60只，6周齡，體重(200±20)g，SPF級(jí)別，雌雄各半，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2004-0007。實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲水和采食，室溫(25±1)℃，光照明暗各12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物及制備氫化可的松注射液(10 mg/2 ml)，由上?，F(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：11072512，國(guó)藥準(zhǔn)字H41021930)。腺嘌呤：(Amresco公司分裝產(chǎn)品，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)，5 g由蒸餾水溶解為20 mg/ml的水溶液；加味參附湯：附子、人參、蛤蚧、地龍、水蛭、法半夏購(gòu)于湖北省中醫(yī)院，常規(guī)煎煮制成2.0 g/ml的加味參附湯，避光4℃冰箱保存，2 w內(nèi)有效；博來(lái)霉素A5(15 mg/支)為天津太河制藥有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：060401)生產(chǎn)，臨用前將博來(lái)霉素A5溶于蒸餾水中，并于超聲波振蕩15 min以保證分散均勻，稀釋為5 mg/ml的混懸液，即配即用。

1.3主要試劑CTGF單克隆抗體(sc-365970)，Santa Cruz公司分裝，辣根酶標(biāo)記羊抗鼠二抗,蛋白Marker：美國(guó)Amresco公司；免疫組化試劑盒：武漢博士德公司；RNAlater組織保護(hù)液公司,Trizol組織裂解液：美國(guó)Invitrigen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Promega公司，PCR試劑盒及熒光定量PCR試劑(SYBRGreen Premix ExTaqTM)：日本TOYOBO公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物造模參照楊禮騰等〔3〕制作腎陽(yáng)虛肺纖維化大鼠模型，大鼠稱(chēng)重后經(jīng)乙醚麻醉，氣管內(nèi)插管一次性注入博來(lái)霉素A5(5 mg/kg)，從當(dāng)天開(kāi)始灌胃腺嘌呤(300 mg/kg體重)連續(xù)28 d，建立腎陽(yáng)虛肺纖維化模型。

1.4.2動(dòng)物分組和給藥方法Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為正常組、模型組、干預(yù)組，每組20只。正常組氣管內(nèi)插管注入生理鹽水(1 ml/kg體重)，2 h后，生理鹽水(15 ml/kg體重)灌胃連續(xù)28 d，后生理鹽水(5 mg/kg)繼續(xù)灌胃1連續(xù)14 d后處死。模型組氣管內(nèi)插管一次性注入博來(lái)霉素A5(1 ml/kg)，2 h后，每天腺嘌呤(15 ml/kg)灌胃,連續(xù)28 d，然后大鼠生理鹽水(5 mg/kg體重)灌胃，每天一次，連續(xù)14 d后處死。干預(yù)組氣管內(nèi)插管一次性注入博來(lái)霉素A5(1 ml/kg)，2 h后，每天腺嘌呤(15 ml/kg)灌胃連續(xù)28 d，然后大鼠“加味參附湯”水煎劑(5 ml/kg)灌胃，每天一次，連續(xù)14 d后處死。

1.4.3標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.3.1尿17-羥皮質(zhì)類(lèi)固醇(17-OH-CS)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)第42天,將大鼠依次置于相應(yīng)標(biāo)記的大鼠代謝籠內(nèi),為了增加尿量，于早8∶00到晚11∶00每間隔3 h灌胃生理鹽水2 ml，共6次。收集24 h尿液，滴加防腐劑0.1 ml/10 ml防腐，-20℃保存，高嶺土法進(jìn)行17-羥皮質(zhì)類(lèi)固醇(17-OH-CS)的檢測(cè)。

1.4.3.2HE染色觀察大鼠肺組織病理組織結(jié)構(gòu)頸動(dòng)脈放血處死實(shí)驗(yàn)大鼠，取肺組織投入10%中性甲醛磷酸鹽緩沖液固定，常規(guī)石蠟切片、HE染色觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠肺組織顯微鏡下形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，按照Szapiel等〔4〕提供的方法,對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肺泡炎及肺纖維化程度進(jìn)行半定量分析。

1.4.3.3MASSON染色觀察各組大鼠肺組織纖維化程度肺組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟至水，依次自來(lái)水和蒸餾水洗，Mayer蘇木素溶液染核7～9 min，充分水洗,如過(guò)染可鹽酸酒精分化，用Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min，入冰醋酸水溶液中浸洗片刻，移入1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經(jīng)水洗,直接移入亮綠水溶液中浸染5 min，入冰醋酸水溶液中浸洗，95%酒精、無(wú)水酒精、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。結(jié)果判斷：綠色：膠原纖維；橘紅色：紅細(xì)胞；紅色：細(xì)胞質(zhì)；深藍(lán)色：細(xì)胞核。

1.4.3.4免疫組化檢測(cè)CTGF在肺內(nèi)的表達(dá)肺組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟至水，經(jīng)3%過(guò)氧化氫室溫孵育、水洗，抗原熱修復(fù)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)行常規(guī)SP水平法染色，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。胞質(zhì)、胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表現(xiàn)，全自動(dòng)數(shù)碼顯微鏡捕捉到圖像采集窗口的免疫組化彩色圖像，通過(guò)灰度直方圖來(lái)調(diào)節(jié)分割范圍和閾值，已分割好的圖像自動(dòng)計(jì)算每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值〔5〕。

1.4.3.5Western印跡檢測(cè)CTGF含量肺組織加細(xì)胞裂解液經(jīng)機(jī)械和超聲勻漿，4℃低溫，12 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm。BCA法測(cè)總蛋白質(zhì)濃度。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，各樣品取50 μg總蛋白上樣電泳，分離蛋白并轉(zhuǎn)到硝酸纖維素濾膜上， 轉(zhuǎn)膜完畢后，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫?fù)u床封閉，加入一抗4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗以結(jié)合一抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。使用BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.4.3.6RT-PCR檢測(cè)CTGF mRNA含量用勻漿器攪勻肺組織樣品，每50～100 mg組織加入1 ml Trizol，提取總RNA，按試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：CTGF上游引物：5′-CCAATGACAATACCTTCTGC-3′，下游引物：5′-GAAAGCTAAACTTGACAGG-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度148 bp;β-actin上游引物：5′-GTATGACTCTACCCACGGCCAAG-3′，下游引物：5′-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度101 bp。反應(yīng)完成后，軟件將自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，調(diào)整基線(xiàn)，計(jì)算Threshold cycle(Ct值)。采用2-△△CT法〔6〕分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況正常組大鼠一般狀態(tài)好取食活躍、體重增加、皮毛光滑、口唇紅潤(rùn)；第28天模型組和干預(yù)組大鼠取食排便活動(dòng)均減少、出現(xiàn)毛發(fā)無(wú)光澤、豎毛、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、體溫下降、倦縮拱背、口唇蒼白、尾巴濕冷、大便稀軟；第42天模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)脫落，嗜睡、體重進(jìn)一步下降，而干預(yù)組大鼠活動(dòng)較42 d略有恢復(fù)，取食較活躍、體重稍有增加。

2.2各組大鼠肺組織病理學(xué)變化對(duì)照組：大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,氣管及支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列尚規(guī)整，杯狀細(xì)胞增生，肺內(nèi)各級(jí)小支氣管、細(xì)支氣管及其伴行的管壁及周?chē)猩僭S中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，血管腔充血。肺泡間隔基本正常，肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)可見(jiàn)少量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，MASSON染色在肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量條索狀膠原纖維。模型組：大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯,氣管及支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列紊亂，杯狀細(xì)胞大量增生，肺內(nèi)各級(jí)小支氣管、細(xì)支氣管及其伴行的管壁及周?chē)梢?jiàn)大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增寬，幾乎未見(jiàn)正常肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡明顯萎縮塌陷，MASSON染色可見(jiàn)大量寬帶狀及片狀膠原纖維，呈彌漫性肺纖維化改變。干預(yù)組：大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞,氣管及支氣管黏膜上皮細(xì)胞增生明顯，肺內(nèi)各級(jí)小支氣管、細(xì)支氣管及其伴行的管壁及周?chē)梢?jiàn)較多中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔稍增寬，部分肺泡腔消失,為大量膠原纖維、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所占據(jù)，MASSON染色可見(jiàn)部分肺間質(zhì)為膠原纖維所填充。見(jiàn)圖1，圖2。

模型組在造模期間因氣管插管引起強(qiáng)烈刺激而死亡兩只，在后期因衰竭而死亡兩只，故最后為16只，干預(yù)組在造模期間因氣管插管引起強(qiáng)烈刺激而死亡兩只，故最后為18只，與模型組進(jìn)行比較，干預(yù)組實(shí)驗(yàn)大鼠肺泡炎程度和肺纖維化程度較輕(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠肺泡炎與肺纖維化程度的形態(tài)學(xué)觀察 ± s)

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

圖1　大鼠肺組織病理組織學(xué)檢查(HE，×40)

圖2　各組大鼠肺組織MASSON染色(×100)

2.3實(shí)驗(yàn)大鼠尿17-OH-CS含量與對(duì)照組〔(13.604±2.521)mmol/L〕比較，模型組〔(5.324±2.412)mmol/L〕和干預(yù)組〔(11.927±0.848)mmol/L〕大鼠的尿17-OH-CS含量較正常組降低(P<0.05)，與模型組相比較，干預(yù)組大鼠尿17-OHCS含量明顯升高(P<0.05)。

2.4實(shí)驗(yàn)大鼠免疫組化檢測(cè)CTGF在肺內(nèi)的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠平均灰度值顯著升高(P<0.05)，干預(yù)組大鼠平均灰度值顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組大鼠平均灰度值顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠肺組織CTGF陽(yáng)性細(xì)胞、CTGF蛋白的

2.5實(shí)驗(yàn)大鼠Western印跡檢測(cè)肺內(nèi)CTGF蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果正常組CTGF蛋白的灰度值最小，條帶最細(xì)，模型組CTGF蛋白灰度值最大，條帶最粗。與正常組比較，模型組大鼠平均灰度值顯著升高(P<0.05)，干預(yù)組大鼠平均灰度值顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組大鼠平均灰度值顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.6實(shí)驗(yàn)大鼠肺內(nèi)CTGF mRNA含量檢測(cè)結(jié)果與正常組比較，模型組和干預(yù)組大鼠肺內(nèi)CTGF mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)，與模型組比較，干預(yù)組中CTGF mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

3討論

中醫(yī)經(jīng)典文獻(xiàn)中沒(méi)有和肺纖維化相同的病名，學(xué)者們認(rèn)為肺纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“肺痿”范疇〔7〕，發(fā)病多與體質(zhì)虛弱、飲食、勞倦、內(nèi)傷等因素有關(guān)，又復(fù)感外邪，導(dǎo)致肺氣先傷，故有呼吸急促、氣短之狀；腎為肺之子，主納氣，為氣之根，肺病虛損，久則母病及子，造成腎氣虛弱，不能納氣歸元，導(dǎo)致氣浮于上，故發(fā)為喘促，動(dòng)則尤甚。氣管灌注博來(lái)霉素是西醫(yī)研究肺纖維化的經(jīng)典模型,為了符合中醫(yī)辨證論治的特點(diǎn)，并結(jié)合臨床常用的證型，我們選擇了腎陽(yáng)虛肺纖維化模型。

研究表明，在正常肺組織中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是一種高度動(dòng)態(tài)的基質(zhì)，它的合成與降解受到精確地調(diào)節(jié)，許多細(xì)胞因子及通路參與了肺內(nèi)基質(zhì)合成和降解的過(guò)程，不過(guò)在慢性肺損傷過(guò)程中，ECM的合成遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其降解，結(jié)果就是逐步形成鐵絲網(wǎng)格纖維隔膜，以及膠原蛋白之間的化學(xué)交聯(lián)，最終形成肺纖維化。Pan等〔2〕觀察到在肺纖維化患者肺組織中可見(jiàn)CTGF表達(dá)在增生的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和活化的成纖維細(xì)胞這兩種細(xì)胞中，而且患者CTGF蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，提示肺纖維化的組織細(xì)胞可以通過(guò)產(chǎn)生CTGF，直接刺激纖維生成，導(dǎo)致肺組織內(nèi)ECM增生，肺泡結(jié)果破壞，肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞被瘢痕組織取代，最終造成肺纖維化。CTGF可作為抗纖維化治療很有吸引力的靶基因，生理?xiàng)l件下表達(dá)水平很低，其作用范圍也主要局限于結(jié)締組織，CTGF具有較強(qiáng)的絲裂原活性，能刺激成纖維細(xì)胞的活化、增殖，能促進(jìn)多種ECM成分如蛋白多糖、糖蛋白膠原Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ以及纖維連接蛋白、層黏蛋白的產(chǎn)生；抑制ECM的降解，能夠介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的黏附，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向纖維連接蛋白黏附的作用〔8〕。CTGF高表達(dá)可以使血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)率、遷移率顯著增加，還可以促進(jìn)胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)及移植，促進(jìn)新生血管的生成等。劉濤等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)苦參堿及地塞米松可能是通過(guò)抑制TGF-β1和CTGF的表達(dá)來(lái)減少Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的生成,從而減緩肺纖維化的形成。劉朝陽(yáng)等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)CTGF單鏈抗體可明顯減輕纖維化程度,有可能成為治療肺纖維化一種新的藥物。以上研究表明CTGF蛋白通過(guò)促進(jìn)ECM的生成而加速肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

《類(lèi)證治裁·肺癰肺萎葉》指出：“肺萎傷在無(wú)形之氣，氣傷則調(diào)其元。”肺纖維化的干預(yù)上應(yīng)以扶正固本為主，以益氣補(bǔ)肺益腎為法，佐以活瘀。基于前期研究顯示〔11〕該腎陽(yáng)虛肺纖維化模型是成功的，加味參附湯可以明顯抑制肺內(nèi)細(xì)胞的凋亡，因此本次實(shí)驗(yàn)在成功復(fù)制腎陽(yáng)虛肺纖維化模型后，以益氣溫陽(yáng)的參附湯為主方，進(jìn)行加減組成由附子、人參、蛤蚧、地龍、水蛭、法半夏組成的“加味參附湯”對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)加味參附湯干預(yù)的實(shí)驗(yàn)大鼠肺內(nèi)CTGF表達(dá)明顯低于模型組，因此我們推測(cè)加味參附湯除了抑制肺內(nèi)細(xì)胞的凋亡，其抑制肺泡上皮細(xì)胞和活化的成纖維細(xì)胞中CTGF的表達(dá)、改善肺內(nèi)膠原的沉積，也可能是該方減緩肺纖維化發(fā)生的又一機(jī)制，這為溫補(bǔ)腎陽(yáng)法的臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

1Lasky JA，Ortiz LA，Tonthat B，etal.Connective tissue growth factor mRNA expression is uprcgulated in bleomycin-induced lung fibrosis〔J〕.Am J Physiol，2008；275(2 Pt 1)：L365-71.

2Pan LH，Yamauchi K，Uzuki M，etal.Type Ⅱ laveolar epithelial cells and interstitial ifbroblasts express connective tissue growth factor in IPF〔J〕.Eur Repir J，2007;17(6)：1220-7.

3楊禮騰,程德云,劉欣,等.腎陽(yáng)虛肺纖維化大鼠模型的研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009;27(3):658-61.

4Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,etal. Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymicmouse〔J〕.Am Rev Respir Dis,1979;120(4):893-9.

5張鳴號(hào)，彭亮，曹軍.顯微圖像分析法與人工計(jì)數(shù)法在免疫組化結(jié)果判讀中的應(yīng)用〔J〕.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009;31(2)：261.

6Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(- Delta Delta C(T)) method〔J〕.Methods，2001;25(4)：402.

7肖小花,李戎,梁繁榮,等.論中醫(yī)“肺痿”一名與“肺纖維化”最為相侔〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志,2012;39(6):1045-7.

8Shi-wen X，Stanton LA，Kennedy L，etal. CCN2 is necessary for adhesive responses to transforming growth factor-betal in embryonic fibroblasts〔J〕.J Biol Chem,2006；281(16)：10715-26.

9劉濤,謝敏,王浩凌,等.苦參堿、γ干擾素對(duì)大鼠肺纖維化干預(yù)作用〔J〕.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008;28(5):592-6.

10劉朝陽(yáng)，王西華.結(jié)締組織生長(zhǎng)因子單鏈抗體對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化程度及羥脯氨酸含量的影響〔J〕.東南大學(xué)學(xué)報(bào),2010;29(2):135-8.

11趙敏,周艷艷.加味參附湯對(duì)腎陽(yáng)虛肺纖維化大鼠凋亡相關(guān)因子caspase-3和Bcl-2表達(dá)的影響〔J〕.新中醫(yī),2014;46(1);178-80.

〔2013-06-15修回〕

(編輯李相軍)