朱明明，賀 靜，樊明濤,*，王樹林

細菌類胡蘿卜素裂解酶酶解蝦青素工藝優(yōu)化

朱明明1，賀 靜1，樊明濤1,*，王樹林2

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016）

目的：從巴氏葡萄球菌發(fā)酵液中分離純化可降解類胡蘿卜素產(chǎn)香的酶，優(yōu)化其降解蝦青素的反應，為后續(xù)鑒定產(chǎn)物提供依據(jù)。方法：利用高效液相色譜分析產(chǎn)物產(chǎn)量變化，應用正交試驗設計，采用DPS軟件進行二次多項式逐步回歸分析，優(yōu)化蝦青素酶解反應條件。結果：類胡蘿卜素裂解酶具有催化蝦青素降解的活性。反應pH值、反應時間、反應溫度及其交互作用對產(chǎn)物產(chǎn)量均有極顯著影響（P＜0.01），反應pH值和反應時間的交互作用對產(chǎn)物產(chǎn)量影響最大，其通徑系數(shù)為12.726 9。利用二次多項式逐步回歸得到蝦青素酶解的最佳反應條件：反應pH 4.5、反應時間7 min、反應溫度50 ℃，在此條件下蝦青素產(chǎn)物的產(chǎn)量總和可達到定義條件下的1.75 倍。結論：該類胡蘿卜素裂解酶對蝦青素降解具有很強的催化活性，得到了產(chǎn)物達到最大產(chǎn)量時的最優(yōu)條件。

類胡蘿卜素裂解酶；蝦青素；產(chǎn)物產(chǎn)量；二次多項式逐步回歸

類胡蘿卜素是一類在自然界中廣泛存在的、由8 個異戊二烯單元相連、并且分子兩端各含有一個不飽和己烯環(huán)的一類四萜化合物的總稱，其中包括環(huán)化的或無環(huán)的胡蘿卜素，以及含有氧原子的胡蘿卜醇等[1-4]。蝦青素是一種紅色天然類胡蘿卜素，廣泛存在于鮭魚、蝦、蟹、觀賞魚和魚卵中以及植物葉、花和水果中[5-7]。蝦青素不僅具有著色功能[8-9]和抗氧化性[10-11]，也可氧化裂解產(chǎn)生香氣物質。蝦青素的降解方法同類胡蘿卜素的降解方法，有物理降解（包括高溫氧化裂解、熱降解和光氧化降解等）、化學氧化降解和生物氧化（主要是酶催化降解）等[12-14]。經(jīng)過降解，可以生成如氧化異佛爾酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮類等C13化合物，這些化合物因為感官閾值較低而成為評價食品質量的重要指標[15-18]。由于微生物酶對蝦青素（類胡蘿卜素）降解有高度選擇性[19-20]，降解產(chǎn)物大多為具有香氣的降異戊二烯化合物，所以，最近幾年在國際上頗受關注，已逐漸成為替代其理化降解的主要方法。

在改善沙棘酒香氣品質的研究中，首次從沙棘汁分離得到一株具有可降解類胡蘿卜素特性的細菌（經(jīng)鑒定為巴氏葡萄球菌）[21]；對該細菌產(chǎn)生的類胡蘿卜素裂解酶[22-23]進行分離純化并對其基本酶學性質進行研究。為進一步了解該類胡蘿卜素裂解酶的底物特異性，了解其對不同類胡蘿卜素底物的作用位點，需對降解中間產(chǎn)物進行研究[24]。由于酶解的中間產(chǎn)物極其不穩(wěn)定，容易受時間、pH值和溫度影響而發(fā)生降解產(chǎn)生香氣物質，因此為了得到中間產(chǎn)物最大產(chǎn)物量進行后續(xù)研究和分析，本實驗以蝦青素為底物，通過二次多項式逐步回歸[25-26]對該類胡蘿卜素裂解酶降解蝦青素的產(chǎn)物進行優(yōu)化，獲得最大產(chǎn)物量，并進行高效液相色譜-質 譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析，以期為研究底物特異性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗室分離保存的巴氏葡萄球菌菌株TS-82。

蝦青素標準品（純度98%） 美國Sigma-Aldrich試劑公司；甲醇（色譜純） 美國Tidia公司；甲基叔丁基醚（色譜純） 上海Aladdin試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

HH恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素裂解酶純酶的制備

在37 ℃、130 r/min條件下，將TS-82在改良查氏培養(yǎng)基[22]中培養(yǎng)12 h。將所得發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。粗酶液經(jīng)過冷凍干燥濃縮后依次上樣于Mono Q10/100柱，高效制備液相色譜和Superdex peptide 10/300多肽分子篩對其進行分離純化，得到單一的類胡蘿卜素裂解酶純酶。

1.3.2 蝦青素標準品儲備液的配制

實驗中以蝦青素標準品為底物。將5 mg蝦青素和1 g吐溫-80溶于20 mL的二氯甲烷溶液中，避光條件下，在通風櫥中不斷振蕩直至二氯甲烷揮發(fā)干凈，加入52 mL無菌蒸餾水混勻，得橘黃色、清澈的儲備液，放置在4 ℃冰箱中待用。該儲備液濃度為160 μmol/L。

1.3.3 體外蝦青素酶解

將15 μg的純酶與280 μmol的底物混合，用蒸餾水定容至2 mL，在反應溫度30 ℃，pH 5.0條件下反應30 min，加入2 倍體積的丙酮溶液終止反應[19]。接著向反應物中加入2 倍體積的正己烷溶液，混合均勻，放置5 min后，5 000×g離心5 min，取上清液即提取出蝦青素及其酶解產(chǎn)物。將上清液在真空離心機中旋轉干燥，得到的殘余物溶解于2 mL丙酮溶液中，置于4 ℃條件下保存，用于HPLC分析。

1.3.4 蝦青素酶解的單因素試驗

體外實驗中均采用280 μmol底物和15 μg純酶進行酶解反應，反應體積2 mL。根據(jù)預實驗結果和參考文獻[24]，選取了反應時間、反應pH值和反應溫度為考察因素進行酶解反應。該類胡蘿卜素裂解酶的最適反應溫度為60 ℃，最適反應pH值為3.0、由于反應溫度過高或反應pH值過低時，中間產(chǎn)物都極其容易降解，故設定如下考察范圍：設定反應溫度30 ℃、反應pH 5.0，考察反應時間0、15、30、45、60 min對蝦青素中間產(chǎn)物相對含量的影響，以反應15 min時得到的2 個產(chǎn)物的總相對含量為100%；設定反應溫度30 ℃、反應時間15 min，考察反應pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0對蝦青素中間產(chǎn)物相對含量的影響，以pH 5.0條件下獲得的2 個產(chǎn)物的總相對含量為100%；設定反應pH 5.0、反應時間30 min，考察反應溫度30、40、50、60、70 ℃對蝦青素中間產(chǎn)物相對含量的影響，以反應溫度30 ℃條件下得到的2 個產(chǎn)物的總相對含量為100%。按照1.3.3節(jié)方法終止反應并提取蝦青素和酶解產(chǎn)物。

1.3.5 蝦青素酶解的正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，采用正交試驗設計方法安排蝦青素酶解產(chǎn)物條件優(yōu)化的試驗，其因素水平具體見表1，通過考察蝦青素酶解產(chǎn)物的相對含量確定最佳的反應條件。

表 1 正交試驗設計因素與水平表Table 1 Factors and their coded levels used in orthogonal array design

1.3.6 蝦青素酶解反應的測定

1.3.6.1 色譜條件

采用HPLC法[19]測定底物的降解和產(chǎn)物的生成。色譜柱：C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相A：甲醇-水-甲基叔丁基醚體積比30∶10∶1，流動相B：甲醇和甲基叔丁基醚等體積混合，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～30 min，0%～100%B，30～35 min，100%B，35～36 min，100%～0%B，36～51 min，0%B；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長460 nm。

1.3.6.2 蝦青素標準曲線的繪制及含量測定

將蝦青素儲備液分別稀釋至40、80、120 μmol/L和160 μmol/L，以蒸餾水做空白，按照1.3.3節(jié)提取方法提取蝦青素，根據(jù)1.3.6.1節(jié)色譜條件得到不同底物濃度的峰面積，用所得數(shù)據(jù)作圖可得蝦青素溶液濃度與峰面積的線性關系。

1.3.6.3 底物轉化率

將15 μg純酶與280 μmol底物混合，用蒸餾水定容至2 mL，反應30 min，測定30 min內蝦青素的降解量。底物轉化率定義為在上述條件下每分鐘底物的降解量，單位μg/min。

1.3.6.4 產(chǎn)物相對含量

通過檢測波長460 nm條件下產(chǎn)物的峰面積可得到產(chǎn)物含量的變化。由于產(chǎn)物還未鑒定，故采用相對含量表示。實驗中選用2 個產(chǎn)物的峰面積總和代表產(chǎn)量總和。在單因素試驗基礎上，定義最優(yōu)條件下得到的2 個產(chǎn)物峰面積總和為100%，其余條件獲得的產(chǎn)物峰面積總和換算為相對含量。

以上所有反應均為3 次平行，取平均值。

2 結果與分析

2.1 蝦青素酶解反應

圖 1 蝦青素酶解產(chǎn)物的液相色譜圖Fig.1 HPLC analysis of astaxanthin cleavage products by purified carotenoid cleavage enzyme in vitro assays

從圖1可以看出，類胡蘿卜素裂解酶具有很強的催化活性，反應30 min可看到顏色明顯發(fā)生變化。圖1a與圖1b的結果相比可看出，蝦青素（X）含量明顯降低，表明類胡蘿卜素裂解酶可以顯著地催化降解蝦青素標準品，而在蝦青素保留時間后的2 個峰的含量明顯增加，即生成產(chǎn)物1和2（命名為X1和X2）。同時測定了產(chǎn)物X1和X2在HPLC洗脫液中的最大吸收波長，其波長分別是472 nm和466 nm。

根據(jù)圖1中蝦青素含量的變化計算出30 min的轉化率為51.12%。與該酶作用于其他底物的催化效率相比，作用于蝦青素的催化效率與角黃素（52.84%）的效率相當，高于作用于β-8′-胡蘿卜醛（22.73%）和β-胡蘿卜素（40.4%），但低于作用于玉米黃質（71.78%）的催化效率[24]，這與Hoffmann等[19]發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜裂解酶對蝦青素的催化效率遠高于玉米黃質和角黃素的催化效率有一定的差異。對于該酶對玉米黃質具有較好的催化活性的機理有待于進一步研究。

2.2 蝦青素標準曲線的建立

以波長460 nm處得到的蝦青素標準品峰面積為橫坐標，蝦青素標準品的濃度為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析。得回歸方程：y=0.02x-3.827（R2=0.985），式中：x為蝦青素的峰面積；y為蝦青素濃度/（μmol/L）。

2.3 單因素試驗結果

圖 2 反應時間對蝦青素酶解中間產(chǎn)物相對含量的影響Fig.2 Effects of incubation time on the relative content of apocarotenoids

2.3.1 反應時間對中間產(chǎn)物X1和X2相對含量的影響由圖2可看出，反應時間對中間產(chǎn)物相對含量有極顯著影響（P＜0.01）。反應初期隨著反應時間的延長，蝦青素中間產(chǎn)物相對含量增加，這是因為酶催化蝦青素降解產(chǎn)生中間產(chǎn)物。反應15 min時，中間產(chǎn)物相對含量最高。隨著時間的延長，中間產(chǎn)物相對含量開始下降。這可能因為隨著時間的延長，中間產(chǎn)物自身不穩(wěn)定，發(fā)生降解，因此反應時間選擇15 min為宜。

2.3.2 反應pH值對中間產(chǎn)物X1和X2相對含量的影響

圖 3 反應pH值對蝦青素酶解產(chǎn)物含量（a）、蝦青素轉化率（b）的影響Fig.3 Effects of pH on the relative content of apocarotenoids and the conversion efficiency of astaxanthin

如圖3a所示，反應pH值對中間產(chǎn)物相對含量的變化有極顯著影響（P＜0.01），反應pH值為5.0時，中間產(chǎn)物相對含量最高。pH值大于5.0后中間產(chǎn)物相對含量明顯降低，這與pH值過高，酶活性受到抑制導致蝦青素轉化率降低相關。而pH值小于5.0時中間產(chǎn)物相對含量也出現(xiàn)明顯降低，分析其原因可能是由于中間產(chǎn)物易受pH值影響，在酸性條件下不穩(wěn)定，發(fā)生降解。同時考察不同pH值對蝦青素酶解轉化率的影響，結果見圖3b。隨著pH值的升高，蝦青素轉化率逐步降低，這與該酶在酸性環(huán)境中的催化作用較強一致。當pH值達到6.0時，蝦青素轉化率幾乎為0，這是因為該類胡蘿卜素裂解酶的最適反應pH值為3.0，而在pH值達到6.0時幾乎完全失活造成的。

由于底物轉化率只與類胡蘿卜素裂解酶活性相關，而中間產(chǎn)物不僅受酶活影響，所處環(huán)境條件對其穩(wěn)定性也有顯著性影響，在酸性條件下很不穩(wěn)定，極其容易降解[24]。雖然催化活性高，底物含量大大減少，但中間產(chǎn)物一方面在酸性條件下不穩(wěn)定，另一方面酶活性變高，而時間還是15 min時，中間產(chǎn)物已發(fā)生降解，兩方面導致產(chǎn)量也大大減少，轉化為具有香氣物質的終產(chǎn)物，因此并不是轉化率越高，中間產(chǎn)物相對含量越高，故從得到中間產(chǎn)物的最大相對含量考慮，反應pH值選擇5.0。2.3.3 反應溫度對中間產(chǎn)物X1和X2相對含量的影響

由圖4a看出，反應溫度對中間產(chǎn)物相對含量變化有極顯著影響（P＜0.01）。反應溫度30 ℃時，中間產(chǎn)物相對含量最高。隨著溫度的升高，中間產(chǎn)物相對含量顯著降低，這是因為中間產(chǎn)物極其不穩(wěn)定，溫度越高，其自身降解越快。而在溫度低于30 ℃時，由于酶的活性受到抑制，導致催化效率低，致使中間產(chǎn)物相對含量較低。同時考察不同溫度對蝦青素酶解轉化率的影響，結果見圖4b。反應溫度在30～60 ℃時蝦青素轉化率升高較快，而后隨著溫度上升，轉化率幾乎不變，在溫度高于70 ℃后蝦青素轉化率降低，這可能因為雖然隨著反應溫度的升高，酶的活性增加，催化蝦青素快速降解，但溫度過高破壞了酶的結構，使酶失活，從而影響蝦青素的降解。

圖 4 反應溫度對蝦青素酶解產(chǎn)物含量（a）、蝦青素轉化率（b）的影響Fig.4 Effects of temperature on the relative content of apocarotenoids and the conversion efficiency of astaxanthin

由于底物轉化率只與類胡蘿卜素裂解酶活性相關，而中間產(chǎn)物不僅受酶活影響，所處環(huán)境條件對其穩(wěn)定性也有顯著影響，一方面在高溫條件下很不穩(wěn)定，極其容易降解[24]，另一方面酶活性變高，底物轉化率升高，但依舊15 min時中間產(chǎn)物已發(fā)生降解，因此并不是轉化率越高，中間產(chǎn)物相對含量越高，即從酶的活性和中間產(chǎn)物穩(wěn)定性兩方面考慮，選擇反應溫度為30 ℃。

2.4 正交試驗及二次多項式逐步回歸分析

2.4.1 二次多項式回歸方程的建立

表 2 正交試驗設計結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal array design

通過單因素試驗分別考察了反應pH值、反應時間和反應溫度對中間產(chǎn)物相對含量的影響后，選用正交試驗探討這3 個因素對中間產(chǎn)物相對含量的影響，結果見表2。

對正交試驗結果進行二次多項式逐步回歸分析，由DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)擬合得出數(shù)學模型的回歸方程：

Y=-1 064.22 ＋1 030.33X1-42.74X2-51.44X3-125.63X1X1-0.16X2X2＋0.70X3X3＋10.90X1X2-0.15X2X3

（式中：Y是2 個中間產(chǎn)物相對含量總和；此時定義反應時間30 min、pH 5.0、溫度30 ℃條件下的相對含量為100%）。同時得到二次多項式逐步回歸方程的相關統(tǒng)計學指標：相關系數(shù)R=0.997 7、F=490.501 3、P=0.000 1，調整后的相關系數(shù)Ra=0.996 7，剩余標準差s=3.426 1，Durbin-Waston統(tǒng)計量d=1.945 206 93。由以上回歸方程統(tǒng)計學指標可以看出，回歸方程能夠正確反映各因素與中間產(chǎn)物相對含量之間的關系，可靠性較高，同時因為R＞Ra，Y回歸效果顯著。

2.4.2 反應pH值、反應時間、反應溫度及其交互作用對中間產(chǎn)物相對含量的影響

表 3 優(yōu)化條件下各因素與中間產(chǎn)物相對含量的直接通徑系數(shù)Table 3 Direct path coefficients between main factors and the yield of apocarotenoids under optimized reactionconditions

從各影響因素的方程回歸系數(shù)來看，反應pH值、反應時間和反應溫度與中間產(chǎn)物相對含量的相關性與單因素試驗結果一致，而反應pH值和反應時間的交互作用與中間產(chǎn)物相對含量呈正相關關系，反應時間和反應溫度的交互作用與中間產(chǎn)物相對含量呈負相關關系。

在回歸方程條件下，各因素與中間產(chǎn)物相對含量的直接通徑系數(shù)見表3。各因素對中間產(chǎn)物相對含量的相對重要性按直接通徑系數(shù)（絕對值）從大到小排序依次是X1X2、X1、X3、X2、X2X3（X1與合并，X3與合并，X2與X22合并），即反應pH值和反應時間的交互作用（X1X2）對中間產(chǎn)物相對含量的影響較大，而反應時間和反應溫度的交互作用（X2X3）對其影響較小。

2.4.3 驗證實驗結果

回歸方程最終得到最高指標時各個因素組合為Y=194.844 6、X1=4.5、X2=7、X3=50，即反應pH值為4.5、反應時間7 min、反應溫度50 ℃，在此條件下的中間產(chǎn)物相對含量為定義條件下的2 倍。為檢驗預測結果的可靠性，采用上述優(yōu)化酶解反應條件進行蝦青素酶解反應，3 次平行實驗得到的實際中間產(chǎn)物相對含量為定義條件下的1.75 倍，與最優(yōu)理論值相近，比9 組試驗數(shù)據(jù)都高，說明此優(yōu)化結果對實驗指導有一定的價值。

3 結 論

巴氏葡萄球菌菌株TS-82分離純化得到的類胡蘿卜素裂解酶具有催化蝦青素降解產(chǎn)香的功能，其中間產(chǎn)物X1和X2可通過HPLC檢測到，最大吸收波長分別是472 nm和466 nm。反應pH值、反應時間、反應溫度及其交互作用對中間產(chǎn)物相對含量均有極顯著作用（P＜0.01），在優(yōu)化條件下，反應pH值和反應時間的交互作用對中間產(chǎn)物相對含量影響最大，其通徑系數(shù)為12.726 9。二次多項式逐步回歸優(yōu)化蝦青素酶解的最佳工藝條件為反應pH值4.5、反應時間7 min、反應溫度50 ℃，按此條件，蝦青素中間產(chǎn)物相對含量可達到定義條件下的1.75 倍。該方法可以提高產(chǎn)物含量，節(jié)省時間，為進一步研究產(chǎn)物結構和該酶的催化機理提供依據(jù)。

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Optimization of Conditions for Astaxanthin Cleavage by a Bacterial Carotenoid Cleavage Enzyme

ZHU Mingming1, HE Jing1, FAN Mingtao1,*, WANG Shulin2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016, China)

Objective: This work aimed to optimize the conditions for the degrada t ion of astaxanthin by a purifi ed carotenoid cleavage enzyme from Staphylococcus pasteuri. Methods: The degradation products were measured by HPLC. Orthogonal arrays design combined with quadratic polynomial stepwise regression analysis was applied to optimize the conditions for astaxanthin degradation. Results: The HPLC analysis showed that this carotenoid cleavage enzyme had the ability to degrade astaxanthin. pH, time, temperature and their interactions had significant effects on the contents of degradation products (P ＜ 0.01). The interaction between pH and time showed the most signifi cant contribution to the contents of degradation products under the optimized conditions with a value of direct path coeffi cient of 12.726 9. The optimal reaction conditions were determined as follows: pH 4.5, and incubation at 50 ℃ for 7 min. Under these conditions, the total yield of degradation products was 1.75 times higher than the defi ned apocarotenoids yield. Conclusion: This carotenoid cleavage enzyme has a high ability to cleave astaxanthin. The optimal conditions for maximum yield of products have been obtained.

a carotenoid cleavage enzyme; astaxanthin; yield of apocarotenoids; quadratic polynomial stepwise regression analysis

Q556

A

1002-6630（2015）08-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201508001

2014-06-12

國家自然科學基金面上項目（31171728）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31060225）

朱明明（1989—），女，博士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：happyzhumingming@126.com

*通信作者：樊明濤（1963—），男，教授，博士，主要從事食品微生物及食品安全研究。E-mail：fanmt@nwsuaf.edu.cn