范三紅，胡雅喃，何 亞

響應(yīng)面法優(yōu)化菊芋渣酶解制備抗氧化肽工藝

范三紅，胡雅喃，何 亞

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

以菊芋渣蛋白為原料，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計選出最顯著的因素，即底物質(zhì)量濃度、酶解時間、pH值，再用響應(yīng)面分析法對其進行考察，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為評價指標，優(yōu)化菊芋渣抗氧化肽酶解工藝。結(jié)果表明，最佳酶解條件為加酶量8 000 U/g、酶解溫度50 ℃、pH 5.0、酶解時間3.5 h、底物質(zhì)量濃度0.16 g/mL，在此條件下DPPH自由基清除率實測平均值達88.10%，與預(yù)測值88.08%相近。

響應(yīng)面；菊芋渣蛋白；酶解工藝；抗氧化肽

自由基是機體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，對機體的組織和細胞可造成損害?？寡趸瘎┳鳛橐活愔匾纳锘钚晕镔|(zhì)，可清除人體代謝過程中產(chǎn)生的自由基，具有延緩機體衰老的功效。但研究表明，一些人工的合成抗氧化劑，如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和丁基羥基茴香醚等，能夠抑制人體的呼吸酶活性，使用過量甚至可致畸、致癌，因此研究低毒、高效的天然抗氧化劑變成了重點。

目前，制備抗氧化肽的原料來源廣泛，如大豆蛋白[1］、乳蛋白［2］、菜籽［3］、大米［4］等植物蛋白原料中均有抗氧化作用的活性肽。我國有大量的蛋白資源，但利用率都不高，常常作為廢料丟棄，因此如何有效利用蛋白原料，具有重要的現(xiàn)實意義。

目前對于菊芋的研究主要集中在菊粉的開發(fā)應(yīng)用[5-6]，而對脫糖后菊芋渣中蛋白質(zhì)[7]的研究較少，特別是菊芋渣多肽的開發(fā)仍處于空白階段，故有很大的研究空間。菊芋渣是菊芋生產(chǎn)菊粉后的主要副產(chǎn)物，其中粗蛋白含量達9.6%，且氨基酸的利用率相對較高，屬于一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)。1 t菊芋塊莖加工后可得650 kg菊芋渣[7]，產(chǎn)量巨大，直接廢棄造成資源的浪費。本實驗旨在利用酸性蛋白酶酶解菊芋渣蛋白制備抗氧化肽，同時應(yīng)用響應(yīng)面法[8-9]優(yōu)化酶解工藝，為菊芋渣蛋白的充分利用及菊芋渣多肽深入研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊芋渣分離蛋白（總蛋白含量85.19%） 實驗室自制；酸性蛋白酶（50 000 U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16A-WS型高速離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；BS 124 S型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；SP-2000UV型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 杭州儀表電機有限公司；868型酸度計 美國奧利龍公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除率的測定

采用比色法[10-11]，各溶液混勻，避光反應(yīng)30 min，517 nm波長處測定吸光度，公式如下：

式中：A1為2 mL 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液＋2 mL蛋白酶解液（稀釋100 倍）吸光度；A2為2 mL無水乙醇＋2 mL蛋白酶解液（稀釋100倍）吸光度；A3為2 mL 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液＋2 mL無水乙醇吸光度。

1.3.2 菊芋渣蛋白酶解工藝流程

一定質(zhì)量濃度的蛋白液→沸水浴10 min→冷卻后調(diào)pH值，按一定比例加入蛋白酶，酶解一定時間→沸水浴滅酶10 min→5 000 r/min離心15 min→上清液待測

1.3.3 單因素試驗

pH值的確定：取0.08 g/mL菊芋渣蛋白液，在pH值分別為2、3、4、5、6條件下，加酶量4 000 U/g、酶解溫度50℃、酶解時間2 h，測定DPPH自由基清除率；酶解時間的確定：取0.08 g/mL菊芋渣蛋白液，酶解時間分別為2、4、6、8、10 h，加酶量4 000 U/g、酶解溫度50 ℃、pH 4，測定DPPH自由基清除率；酶解溫度的確定：取0.08 g/mL菊芋渣蛋白液，酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，加酶量4 000 U/g、pH 4、酶解時間2 h，測定DPPH自由基清除率；底物質(zhì)量濃度的確定：取質(zhì)量濃度分別為0.08、0.1、0.12、0.14、0.16 g/mL的菊芋渣蛋白液，加酶量4 000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h、pH 4，測定DPPH自由基清除率；加酶量的確定：取0.08 g/mL菊芋渣蛋白液、pH 4、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h，加酶量分別為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g，測定DPPH自由基清除率。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素的基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除率為指標，確定Plackett-Burman篩選試驗[12-13]的因素和水平，結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面分析法進行三因素三水平試驗[14-15]，優(yōu)化酶解工藝。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用軟件Minitab 15.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 pH值對DPPH自由基清除率的影響

圖 1 pH值對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of initial hydrolysis pH on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

pH值的改變會影響酶與底物的結(jié)合情況，影響酶活性部位有關(guān)基團的解離狀態(tài)，每一個催化反應(yīng)都有最適pH值[16]。由圖1可看出，最適pH值是4.0。pH值小于4.0時，反應(yīng)速率隨pH值升高而增大，酶解液DPPH自由基清除率增大，pH值大于4.0時，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酶活力變差，反應(yīng)速率下降。因此初步選定pH值為4.0。

2.1.2 酶解時間對DPPH自由基清除率的影響

圖 2 酶解時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

由圖2可看出，酶解的最佳時間為4 h，2～4 h范圍內(nèi)DPPH自由基清除率明顯上升，之后緩慢下降?？赡苁请S著酶解時間的延長，底物質(zhì)量濃度逐漸減少，酶和底物的結(jié)合位點隨之減少，反應(yīng)越來越慢，達到一定的動態(tài)平衡，同時酶的活力也隨之降低[17]，隨著時間的延長，一些酶解出來的多肽被進一步分解，從而導(dǎo)致氨基酸結(jié)構(gòu)序列發(fā)生變化，而多肽的抗氧化性與此有很大的關(guān)系[18-19]。綜合考慮，酶解時間為4 h。

2.1.3 酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響

每一種酶都有其最適溫度，在這一溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，酶活性增大，溫度過高或過低，可能會使酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酶活性就越小，甚至有可能會失活。由圖3可知，酶解溫度在50 ℃時效果最好，其余溫度條件下清除率均較小。

圖 3 酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

2.1.4 底物質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率的影響

圖 4 底物質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

底物質(zhì)量濃度的大小影響底物與酶結(jié)合位點的多少，底物質(zhì)量濃度小時，底物與酶結(jié)合位點較少，反應(yīng)速率慢，隨著質(zhì)量濃度增加，反應(yīng)速率加快，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達到一定程度時，溶液過于黏稠，影響了底物與酶的結(jié)合[20]，且到達一定量時，酶與底物全部結(jié)合，雖然質(zhì)量濃度增加，但沒有多余的酶與之結(jié)合[21]，DPPH自由基清除能力不再變化。由圖4可知，底物質(zhì)量濃度在0.12、0.14、0.16 g/mL時相差不大，從原料方面考慮，選擇最佳質(zhì)量濃度為0.12 g/mL。

2.1.5 加酶量對DPPH自由基清除率的影響

圖 5 加酶量對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

底物質(zhì)量濃度一定時，加酶量對反應(yīng)速率有極大的影響。加酶量少，則與底物相結(jié)合的酶分子少，反應(yīng)速率慢。隨著加酶量的增加，與之相結(jié)合的酶分子增加，反應(yīng)速率加快。當(dāng)加酶量過多，酶分子過飽和，反應(yīng)速率不再變化。由圖5可知，加酶量為8 000 U/g時DPPH自由基清除率最大，其他條件下則較低，綜合考慮，加酶量為8 000 U/g。

2.2 酸性蛋白酶酶解菊芋渣蛋白的響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表 1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Response surface experimental design and results

表 2 回歸方程方差分析Table 2 Analysis of variances for the fitted regression modelTable 2 Analysis of variances for the fitted regression model

表 3 回歸系數(shù)顯著性分析Table 3 Significant test for each regression coefficient of theTable 3 Significant test for each regression coefficient of the fitted regression model del

綜合單因素和Plackett-Burman試驗，應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計原理[22]，采用不同底物質(zhì)量濃度、pH值、酶解時間進行15 組試驗。使用Minitab 15.0軟件對表1進行分析，得到DPPH自由基清除率為響應(yīng)值的多元二次回歸方程：Y=85.592 6＋1.909 9A-1.587 4B＋2.022 1C-1.872 0A2-3.517 8B2-1.661 8C2＋0.503 7AB＋1.914 0AC-0.474 0BC。

從表2可看出，該模型回歸顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.735＞0.05），說明模型較準確。二次項和交互項對該模型具有顯著性（P＜0.05），說明這兩項對響應(yīng)值的影響很大。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=97.46%，說明試驗值和擬合值高度相關(guān)，校正決定系數(shù)R2Adj=92.90%，說明該模型能解釋92.90%響應(yīng)值的變化，擬合度大于90%，說明方程差異顯著。

從表3回歸系數(shù)顯著性分析可得出，C2響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），A、B、C、A2、B2、AC這幾個因素對響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01），表明在酶解的過程中，底物質(zhì)量濃度、pH值、酶解時間對清除率有顯著的影響，可見，A、B、C、A2、B2、C2、AC對響應(yīng)值的影響是非線性的。

2.2.2 各因素間交互作用

圖 6 底物質(zhì)量濃度與酶解時間交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Response surface plot showing the effect of substrate concentration and hydrolysis time on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

圖 7 底物質(zhì)量濃度與pH值交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Response surface plot showing the effect of initial pH and substrate concentration on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

圖 8 pH值與酶解時間交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Response surface plot showing the effect of initial pH and hydrolysis time on the DPPH radical scavenging activity of protein hydrolysates

由圖6～8響應(yīng)面圖和等高線圖可以看出該模型存在最大值。利用Minitab 15.0的響應(yīng)優(yōu)化器可得出最佳酶解條件是底物質(zhì)量濃度0.16 g/mL、酶解時間3.57 h、pH 5.0，在此條件下，DPPH自由基清除率的預(yù)測值為88.08%。為了驗證實驗的可靠性，將各參數(shù)進行修正為底物質(zhì)量濃度0.16 g/mL、酶解時間3.5 h、pH 5.0。對上述條件進行驗證實驗，得到平均清除率為88.10%（重復(fù)3 次），與預(yù)測值相近，說明所得參數(shù)可靠，該模型能較好地預(yù)測菊芋渣抗氧化肽酶解工藝，具有實際意義。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將Plackett-Burman篩選試驗與響應(yīng)面法結(jié)合，確定出顯著因素，避免了其他因素可能造成的資源浪費，并對其進行優(yōu)化得到最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度0.16 g/mL、加酶量8 000 U/g、酶解溫度50 ℃、pH 5.0、酶解時間3.5 h，在此條件下DPPH自由基清除率為88.10%。實驗證明，該模型合理。通過實驗可以看出，資源利用率較高，菊芋渣有著很大的研究空間。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Jerusalem artichoke Residue for Preparing Antioxidant Peptides by Response Surface Methodology

FAN Sanhong, HU Ya’nan, HE Ya
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Antioxidant peptides were prepared by enzymatic hydrolysis of Jerusalem artichoke tuber residue protein with an acid protease. Substrate concentration, hydrolysis time and pH were identified by the combined use of single factor method and Plackett-Burman design as the factors with the most significant influence on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of protein hydrolysate. The optimal hydrolysis conditions for enzyme dosage, temperature, pH, time and substrate concentration were determined by response surface methodology to be 8 000 U/g, 50 ℃, pH 5.0, 3.5 h and 0.16 g/mL, respectively. Under these conditions, the predicted DPPH radical-scavenging rate was 88.08%, agreeing with the average experimental value (88.10%).

response surface methodology； Jerusalem artichoke residue protein； enzymatic hydrolysis； antioxidant peptides

TS209

A

1002-6630（2015）08-0049-05

10.7506/spkx1002-6630-201508009

2014-09-11

山西省自然科學(xué)基金項目（2012011031-4）；山西省高等學(xué)校高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項目（20111003）

范三紅（1963—），男，副教授，碩士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn