魏 明，李鴻梅,*，馬艷秋，趙 慧，張桂弘，閔偉紅

響應(yīng)面優(yōu)化羅耳阿太菌胞外多糖提取工藝及其保濕、黏度特性分析

魏 明1，李鴻梅1,*，馬艷秋2，趙 慧1，張桂弘1，閔偉紅1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，吉林 長春 130118）

利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化乙醇醇沉提取羅耳阿太菌胞外多糖（Athelia rolfsii exopolysaccharides，AEPS）工藝，并探究其保濕特性及黏度穩(wěn)定性。以AEPS 提取量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化多糖提取工藝。以殼聚糖和尿素作對照，研究AEPS吸濕及 保濕性能，同時研究溫度、pH值和離子（Mg2＋、Ca2＋、Na＋、K＋）濃度對AEPS黏度穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：AEPS醇沉最佳條件為濃縮倍數(shù)3、醇沉?xí)r間17 h、醇沉溫度5 ℃、無水乙醇體積為發(fā)酵液的1.7 倍，所得AEPS提取量為12.24 g/L；AEPS吸濕及保濕性能明顯優(yōu)于殼聚糖和尿素，1 mg/mL AEPS（黏度57 mPa·s）保濕性最好；在5～95 ℃范圍內(nèi)，35 ℃時AEPS黏度最低，35 ℃以外多糖黏度都高于51 mPa·s，但在pH 1～12、離子濃度0～1.0 mol/L范圍內(nèi)，AEPS黏度幾乎不受影響。

羅耳阿太菌胞外多糖；醇沉；吸濕性；保濕性；黏度穩(wěn)定性

全球食品工業(yè)中每年消耗7萬 t多糖作為增稠劑、穩(wěn)定劑和持水劑[1]。雖然該領(lǐng)域新興多糖需求增加，但市場競爭仍然很激烈，因此成本低廉的多糖需求也在不斷擴(kuò)大。目前，多糖主要來源于植物[2]（如淀粉、纖維素）、海藻類[3]、甲殼類[4]（如藻酸鹽、角叉菜膠、殼聚糖）及微生物[5]（如黃原膠），但對產(chǎn)多糖新原料的探索仍在繼續(xù)[6]。

作為一種新興多糖，羅耳阿太菌胞外多糖（Athelia rolfsii exopolysaccharides，AEPS）是羅耳阿太菌（Athelia rolfsii）分泌的一種大分子胞外β-葡聚糖[7]。Vinarta等[1]研究發(fā)現(xiàn)，羅耳阿太菌多糖可以作為穩(wěn)定劑和持水劑完全抑制淀粉糊在冷藏過程中脫水收縮，但羅耳阿太菌多糖生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低的特點(diǎn)卻使眾多商家在使用過程中望而卻步。本課題組篩得1 株能夠以玉米淀粉、玉米黃漿為碳氮源發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的羅耳阿太菌[8]，這種低成本培養(yǎng)基發(fā)酵所得粗多糖產(chǎn)量為16.135 g/L[9]。以此為基礎(chǔ)，本研究旨在對所獲得的多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)一步研究其吸濕、保濕性及黏度穩(wěn)定性，為低成本生產(chǎn)的羅耳阿太菌多糖在食品工業(yè)和化妝品行業(yè)的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

羅耳阿太菌（Athelia rolfsii）AY6657741由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室分離純化并石蠟封存。玉米淀粉 市購；玉米黃漿（pH 4.16，蛋白含量4.2 g/L）黃龍食品有限公司。

馬鈴薯瓊脂葡萄糖斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH值；發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉35 g/L、玉米黃漿50 mL/L、NaNO33.1 g/L、K2HPO41.0 g/L、 KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、檸檬酸 1.4 g/L，pH 4.5[9-11]；蒽酮、硫酸、氯仿、正丁醇、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純；透析袋（截留分子質(zhì)量為6 000～8 000 D） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZC-Q空氣浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)技術(shù)開發(fā)有限公司；HPX-9082 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；FG2-便攜式pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；HH-8水浴鍋 國華電器有限公司；DCY-0506低溫恒溫槽 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；低溫冷凍高速離心機(jī) 德國Hermle公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52-99 上海亞榮儀器廠；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計 北京愛格森自動化有限公司；S21-3磁力攪拌器上海司樂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AEPS提取工藝流程

羅耳阿太菌（接種量7%）29 ℃、200 r/min培養(yǎng)5.5 d，發(fā)酵液前處理（調(diào)節(jié)pH 7.0，加入1 倍體積蒸餾水，80 ℃水浴30 min）[12]，8 000 r/min離心30 min，Sevag法[13]除蛋白（發(fā)酵液與Sevag質(zhì)量比3∶1，氯仿與正丁醇體積比4∶1，劇烈攪拌20 min，重復(fù)4 次），醇沉，透析（透析袋截留分子質(zhì)量為6 000～8 000 D），進(jìn)行AEPS含量測定。

1.3.2 醇沉AEPS提取量測定

AEPS含量測定采用蒽酮-硫酸法[14]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)作工作曲線，得線性回歸方程：y=0.005 1x-0.000 8（R2= 0.999 8），測定AEPS溶液在630 nm波長處的吸光度，通過回歸方程計算AEPS含量。

1.3.3 醇沉條件單因素試驗(yàn)

取30 mL經(jīng)Sevag法除蛋白的發(fā)酵液，根據(jù)表1所示的醇沉條件變量考察發(fā)酵液pH值、濃縮倍數(shù)、醇沉?xí)r間、醇沉溫度和無水乙醇體積倍數(shù)對AEPS提取量的影響。開展某一單因素試驗(yàn)時，其他不變因素水平分別為：發(fā)酵液pH 7、濃縮倍數(shù)1.5、無水乙醇體積倍數(shù)1、醇沉溫度9 ℃、醇沉?xí)r間8 h。

表 1 醇沉條件單因素水平表Table 1 Single factor design for ethanol precipitation of AEPS

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化AEPS醇沉提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵液濃縮倍數(shù)、醇沉?xí)r間、醇沉溫度和無水乙醇體積倍數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計。以AEPS提取量為響應(yīng)值，確定AEPS最優(yōu)醇沉條件。

1.3.5 AEPS吸濕性及保濕性測定

1.3.5.1 AEPS吸濕性的測定

以具有吸濕性的殼聚糖和尿素為對照，測定AEPS吸濕性。將AEPS、殼聚糖、尿素分別粉碎分散，在90 ℃條件下烘干至質(zhì)量恒定。分別稱取0.200 0 g質(zhì)量恒定的AEPS、殼聚糖、尿素于質(zhì)量恒定的敞口玻璃皿中（每個試樣設(shè)3 個平行），在25 ℃條件下放入裝有1 000 mL飽和(NH4)2SO4溶液的密閉干燥器（相對濕度為81%）中[15-17]。每隔3 h將玻璃皿取出稱質(zhì)量，按公式（1）計算吸濕率。

式中：M0為質(zhì)量恒定玻璃皿與樣品的質(zhì)量/g；Mt為干燥器中放置t小時后玻璃皿和樣品的質(zhì)量/g。

1.3.5.2 AEPS保濕性的測定

將1.3.5.1節(jié)中吸濕24 h后的樣品放入裝有干燥硅膠的干燥器中進(jìn)行保濕實(shí)驗(yàn)，每隔3 h將玻璃皿取出稱質(zhì)量，按公式（2）計算保濕率。

式中：M0為質(zhì)量恒定玻璃皿與樣品的質(zhì)量/g；Ma為放入干燥器a小時后玻璃皿和樣品的質(zhì)量/g；Mb為放入干燥器前玻璃皿和樣品的質(zhì)量/g。

1.3.6 不同黏度AEPS保濕性的測定

在25 ℃條件下，采用 NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計測定不同質(zhì)量濃度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）AEPS溶液絕對黏度。分別吸取10 mL不同質(zhì)量濃度AEPS溶液置于質(zhì)量恒定的敞口玻璃皿中（每個試樣設(shè)3 個平行），在25 ℃條件下放入裝有1 000 mL飽和K2CO3溶液的密閉干燥器（相對濕度為43%）中[18]。每隔3 h將玻璃皿取出稱質(zhì)量，計算保濕率。

1.3.7 AEPS黏度穩(wěn)定性

采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計測定AEPS溶液絕對黏度，考察溫度、pH值、離子濃度對AEPS黏度的影響[19-22]。

1.3.7.1 溫度對AEPS黏度的影響

將1.0 mg/mL AEPS溶液分別置于5～95 ℃（每5 ℃為一梯度）水浴中放置20 min，測定溫度對AEPS溶液黏度的影響。

1.3.7.2 pH值對AEPS黏度的影響

將1.0 mg/mL AEPS溶液pH值分別調(diào)節(jié)至1、3、5、7、9、11、12、13，靜置15min，測定pH值對AEPS溶液黏度的影響。

1.3.7.3 離子（Mg2＋、Ca2＋、Na＋、K＋）濃度對AEPS黏度的影響

向40 mL 1.0 mg/mL AEPS溶液中分別加入20mL 0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mol/L氯鹽（MgCl2、CaCl2、NaCl、KCl）溶液，混勻，空白組加入20 mL蒸餾水，靜置15 min，測定離子濃度對AEPS溶液黏度的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 AEPS醇沉條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖 1 醇沉單因素對AEPS提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol precipitation conditions on AEPS yield

由圖1a可知，在pH 3～11范圍內(nèi)，pH值對AEPS提取量影響很小，基本不變，所以不選擇pH值作為響應(yīng)面分析因素。

由圖1b可知，AEPS提取量隨濃縮倍數(shù)的增大而增大。在濃縮倍數(shù)為1.0時，AEPS提取量為7.70 g/L；濃縮倍數(shù)由1.0提高到2.5的過程中，AEPS提取量明顯增大，而由2.5提高到3.0時，AEPS提取量卻提高緩慢。這可能是由于無水乙醇加入到高質(zhì)量濃度AEPS溶液中時，AEPS容易聚集成較大顆粒，易醇沉，濃縮倍數(shù)過高，AEPS提取量不會顯著提高。因此，選擇濃縮倍數(shù)2.5（即將除蛋白后的發(fā)酵液濃縮到原來體積的2/5）作為響應(yīng)面分析因素水平。

由圖1c可知，AEPS提取量隨醇沉?xí)r間的延長而提高。在醇沉?xí)r間為4 h時，AEPS提取量僅為6.16 g/L；4～16 h內(nèi)，隨醇沉?xí)r間的延長，AEPS提取量顯著提高，而在16～20 h內(nèi)，AEPS提取量幾乎沒有變化。因此選擇16 h作為響應(yīng)面分析因素水平，以有效節(jié)約資源。

由圖1d可知，在醇沉溫度1～5 ℃時，AEPS提取量隨溫度的升高而提高；5～9 ℃時，AEPS提取量隨溫度的提高顯著降低。AEPS提取量在5 ℃時達(dá)最大為11.31 g/L。因此，選擇醇沉溫度5 ℃作為響應(yīng)面分析因素水平。

由圖1e可知，AEPS提取量隨無水乙醇與發(fā)酵液體積比增大而提高。當(dāng)無水乙醇體積倍數(shù)為0.5時，AEPS提取量僅為7.38 g/L，當(dāng)無水乙醇體積倍數(shù)由0.5增加到1.5時，AEPS提取量顯著增大，而無水乙醇體積倍數(shù)由1.5增加到2.5時，AEPS提取量變化不顯著。這可能是由于無水乙醇體積倍數(shù)低時，較小分子質(zhì)量的AEPS不易醇沉，隨無水乙醇體積倍數(shù)增大，AEPS進(jìn)一步發(fā)生醇沉并沉淀完全，AEPS提取量變化不大。因此選擇無水乙醇體積倍數(shù)1.5作為響應(yīng)面分析因素水平。

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化AEPS醇沉條件

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行了29 組試驗(yàn)，其中5 組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表 2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

以AEPS提取量為響應(yīng)值回歸擬合所得各因素函數(shù)表達(dá)如下：AEPS提取量=12.20＋0.24X1＋0.25X2＋8.33×10-3X3＋0.39X4＋5×10-3X1X2-0.013X1X3-0.025X1X4＋0.025X2X3-0.18X2X4＋2.5×10-3X3X4-0.27-0.43-0.47-0.52。

由表3方差分析得出模型極顯著，模型的失擬項不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.995 4，修正決定系數(shù)= 0.990 9，說明方程擬合性較好，可以應(yīng)用于對提取條件的分析預(yù)測。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析：一次項X1、X2、X4極顯著，二次項X2X4、X12、、X32、極顯著。說明該模型擬合程度良好，用該模型對AEPS醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

表 3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for regression model

醇沉條件交互因素響應(yīng)面立體分析圖及等高線圖見圖2。

圖 2 醇沉條件交互作用影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 3D-surface and contour plots for the effect of ethanol precipitation conditions on AEPS yield

從圖2等高線可以看出，醇沉?xí)r間與無水乙醇體積倍數(shù)交互作用圖接近橢圓形，說明其交互作用顯著；醇沉溫度與無水乙醇體積倍數(shù)、醇沉?xí)r間與醇沉溫度的交互作用圖接近圓形，交互作用不顯著；其余因素交互作用圖雖為橢圓，但不足達(dá)到交互作用顯著水平。

2.1.3 AEPS醇沉工藝條件的確定及驗(yàn)證

2.1.2 節(jié)數(shù)據(jù)分析表明，回歸模型存在最大值，AEPS醇沉的最佳工藝條件為：濃縮倍數(shù)3、醇沉?xí)r間16.93 h、醇沉溫度5.01 ℃、無水乙醇體積倍數(shù)1.65。此條件下AEPS提取量理論預(yù)測最大值為12.26 g/L。為方便操作，選擇如下條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：濃縮倍數(shù)3、醇沉?xí)r間17 h、醇沉溫度5 ℃、無水乙醇體積倍數(shù)1.7。所得AEPS提取量為12.24 g/L，達(dá)到預(yù)測值的99.83%。

2.2 AEPS吸濕性及保濕性

圖 3 AEPS、殼聚糖和尿素的吸濕性（a）及保濕性（b）Fig.3 Moisture-absorption and moisture-retention capacities of AEPS, chitosan and urea

如圖3a所示，在相對濕度為81%的條件下，前3 h，3 種樣品吸濕率都隨放置時間的延長而升高，吸濕快慢順序?yàn)椋篈EPS＞尿素＞殼聚糖。12 h之后，雖然殼聚糖和尿素吸濕率略有提高，AEPS吸濕率基本保持不變，但AEPS吸濕率仍高于二者。

如圖3b所示，在干燥硅膠環(huán)境中，3 種樣品的保濕率均隨放置時間延長而下降。前6 h，保濕率下降快慢順序?yàn)椋簹ぞ厶牵灸蛩兀続EPS，說明AEPS的保濕能力明顯高于殼聚糖和尿素。后6 h，尿素的保濕率明顯下降，殼聚糖和AEPS的保濕率趨于平穩(wěn)，但AEPS的保濕性仍高于殼聚糖。

總之，AEPS吸濕速率及24 h內(nèi)吸濕率均高于殼聚糖和尿素，吸濕率最大值為16.09%。而且，在干燥硅膠環(huán)境下，AEPS保濕性最好，12 h后AEPS的保濕率仍為34.02%，這可能是由于AEPS的分子質(zhì)量較大，三螺旋外周含有較多羥基基團(tuán)，使其吸濕、保濕特性優(yōu)于殼聚糖和尿素。因此AEPS可應(yīng)用于保濕化妝品行業(yè)。

2.3 不同黏度AEPS的保濕性

圖 4 AEPS質(zhì)量濃度與黏度的關(guān)系（a）及不同黏度AEPS的保濕性（b）Fig.4 Effects of AEPS concentration on viscosity and moisture-retention capacity of AEPS with different viscosities

由圖4a可知，AEPS黏度隨質(zhì)量濃度的增加而增大，且質(zhì)量濃度與黏度呈線性相關(guān)。由圖4b可知，同一黏度AEPS隨時間延長，保濕率逐漸減小；放置3 h，不同黏度AEPS保濕率幾乎相同，放置6 h后，不同黏度AEPS保濕率差異明顯。低黏度AEPS保濕率降低速率大于高黏度AEPS，且當(dāng)溶液的黏度為57 mPa·s，即質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，AEPS保濕率不隨質(zhì)量濃度的增加而變化，保濕率幾乎不變，說明AEPS最佳保濕黏度為57 mPa·s，即質(zhì)量濃度為1 mg/mL。這可能是由于隨AEPS質(zhì)量濃度的增加，AEPS溶液中的羥基也在不斷增多，AEPS與溶液中水分子形成氫鍵增多[23]，持水能力增強(qiáng)，保濕性增強(qiáng)。

2.4 AEPS黏度穩(wěn)定性

圖 5 溫度（a）、pH值（b）和離子濃度（c）對AEPS溶液黏度的影響Fig.5 Effects of temperature, pH and ion concentration on AEPS viscosity stability

由圖5a可知，1 mg/mL AEPS溶液黏度在35 ℃時達(dá)到最低值為51 mPa·s。當(dāng)溶液溫度小于35 ℃時，隨溫度降低，AEPS黏度值逐漸增大，這可能是由于AEPS在低溫環(huán)境下產(chǎn)生凝膠化，致使黏度增加；當(dāng)溫度高于35 ℃時，隨溫度升高，AEPS溶液黏度值逐漸增大，這可能是由于隨著溫度的升高，AEPS三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生初步解旋，分子間作用力增大，使黏度逐漸增加[24]。

由圖5b可知，AEPS溶液黏度在pH 1～12范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，僅當(dāng)pH＞12時，AEPS溶液黏度迅速下降。這可能是由于在高pH值環(huán)境下，沿多糖鏈分布的高密度電荷導(dǎo)致螺旋內(nèi)部發(fā)生靜電排斥作用[25]，致使多糖螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部氫鍵斷裂，三螺旋結(jié)構(gòu)解旋為單螺旋，造成多糖溶液黏度迅速下降。

由圖5c可知，不同濃度的氯鹽均對AEPS溶液黏度有影響，但影響均不明顯，黏度變化范圍均小于5 mPa·s。這表明，AEPS溶液黏度在一定的電解質(zhì)溶液中顯示出較好的穩(wěn)定性。相比來說，Mg2＋、Ca2＋對AEPS的黏度影響稍大，這可能是由于多糖分子鏈中存在的羥基與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用[26]，導(dǎo)致AEPS分子質(zhì)量變大，溶液黏度增大。

綜上，AEPS溶液黏度受溫度影響較大，溫度變化使其黏度發(fā)生改變，但AEPS溶液黏度在較廣pH值范圍（pH 1～12）及0～1.0 mol/L不同離子溶液中較穩(wěn)定，為AEPS作為增稠劑、穩(wěn)定劑應(yīng)用于食品中提供一定的理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

AEPS醇沉最佳工藝條件為濃縮倍數(shù)3、醇沉?xí)r間17 h、醇沉溫度5 ℃、無水乙醇體積倍數(shù)1.7，所得AEPS提取量為12.24 g/L。AEPS吸濕及保濕性能明顯優(yōu)于殼聚糖和尿素，質(zhì)量濃度為1 mg/mL的AEPS（黏度為57 mPa·s）保濕性最佳。AEPS黏度受pH值及離子濃度變化影響較小，受溫度影響較大，在5～95 ℃范圍內(nèi)，35 ℃時AEPS黏度最低，35 ℃以外多糖黏度都高于51 mPa·s。綜上，AEPS在食品中作為持水劑、增稠劑和穩(wěn)定劑，在化妝品中作為保濕因子具有一定的應(yīng)用前景。

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Extraction and Viscosity Stability of Exopolysaccharides with Moisture-Retention Capacity from Athe lia rolfsii

WEI Ming1, LI Hongmei1,*, MA Yanqiu2, ZHAO Hui1, ZHANG Guihong1, MIN Weihong1
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Jilin Agricultural University Library, Changchun 130118, China)

The conditions of ethanol precipitation for Athelia rolfsii exopolysaccharides (AEPS) were optimized by response surface methodology. Moisture-retention capacity and viscosity stability of AEPS were also determined. Using AEPS yield as the response variable, optimal ethanol precipitation process for AEPS was determined by Box-Behnken design based on single factor tests. Compared to chitosan an d urea, the moisture-absorption and moisture-retention capacities of AEPS were also studied. In addition, the effects of temperature, pH and ion concentration (Mg2+, Ca2+, Na+, and K+) on the viscosity stability of AEPS were examined. The optimal conditions of ethanol precipitation for AEPS were determined as follows: 3-fold condensation of the fermentation supernatant before 17 h precipitation at 5 ℃ with an ethanol/fermentation supernatant ratio of 1.7:1 (V/V). Under these conditions, the AEPS yield was 12.24 g/L. The moisture-absorption and moisture-retention capacities of AEPS were superior to those of chitosan and urea. The optimal concentration for moisture-retention was 1 mg/mL (57 mPa·s). At temperatures in the range of 5–95 ℃, the lowest viscosity of AEPS w as 51 mPa·s at 35 ℃. However, AEPS viscosity was very stable in the pH range of 1 to 12 and at ion concentrations ranging from 0 to 1.0 mol/L.

Athelia rolfsii exopolysaccharides (AEPS)； ethanol precipitation； moisture-absorption capacity；moisture-retention capacity； viscosity stability

TS201.7

A

1002-6630（2015）08-0067-07

10.7506/spkx1002-6630-201508012

2014-09-02

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20126037）

魏明（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榈矸圪Y源開發(fā)與深加工技術(shù)。E-mail：weiming718@163.com

*通信作者：李鴻梅（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹铺枪こ獭-mail：rainbowly71@sina.com