劉 群，段明明，苑純秀，李丹丹，葛 程，馬麗貞，馮新港

（1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海 200241）

·研究論文·

日本血吸蟲PDIA3的原核表達(dá)和多抗血清制備

劉 群1,2，段明明2，苑純秀2，李丹丹1,2，葛 程1,2，馬麗貞2，馮新港2

（1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海 200241）

為獲得日本血吸蟲（Schistosoma japonicum, Sj）PDIA3（SjPDIA3）重組蛋白，并制備多克隆抗體血清，本研究以日本血吸蟲cDNA文庫為模版，利用PCR技術(shù)擴增得到PDIA3 ORF全長，并克隆到pET28a (+) 載體中，將得到的重組質(zhì)粒pET28a-SjPDIA3轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后His-Ni柱親和層析純化得到SjPDIA3重組蛋白，利用重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備多克隆抗體，Western blot分析重組蛋白的免疫原性。擴增得到長為1482 bp日本血吸蟲PDIA3的ORF序列，該序列編碼493個氨基酸，含兩個硫氧還原蛋白結(jié)構(gòu)域和一段信號肽，無擴膜結(jié)構(gòu)。在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)得到大小為55 kDa的SjPDIA3重組蛋白，分析顯示其具有良好的抗原性。

日本血吸蟲; SjPDIA3; 原核表達(dá); 多克隆抗體

血吸蟲病是一種廣泛流行且危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，控制血吸蟲病的傳播是國家亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一[1,2]。由于藥物治療存在重復(fù)感染且反復(fù)使用可能產(chǎn)生耐藥性等弊端，因此，控制血吸蟲病流行依舊依賴于安全有效疫苗的研制。研究表明致弱尾蚴或童蟲免疫的動物模型能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的免疫保護力，但由于存在材料來源困難，使用安全等問題，所以不適于直接應(yīng)用。通過模擬輻照致弱尾蚴或童蟲疫苗（RAV）的效應(yīng)機制來研發(fā)血吸蟲疫苗是一條值得探索的新途徑。我們推斷在RAV模型中，可能存在一類蟲源性分子與它的這種高保護性效應(yīng)機制有關(guān)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在RAV模型中，SjCRT、SjHMGB1和SjHSP70能夠發(fā)生一定的遷移且能活化宿主樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC）[3,4]，形成引發(fā)和驅(qū)使保護性先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的環(huán)境。此外，在腫瘤凋亡細(xì)胞中的相關(guān)研究顯示這類分子的遷移過程與PDIA3（Protein disulfide isomerase A3，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3）具有相關(guān)性[5]。因此我們推測，在RAV模型中，SjPDIA3在SjCRT、SjHMGB1等相關(guān)分子的遷移過程也可能具有相關(guān)功能。

本研究克隆表達(dá)SjPDIA3基因，Western blot分析重組蛋白的免疫原性，制備得到特異性較好的多克隆抗體，為后續(xù)了解RAV模型中相關(guān)蟲源性分子的遷移機制，以及RAV誘異高保護性效應(yīng)的機制等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體與細(xì)胞日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫、原核表達(dá)載體pET28a（+）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲病研究室保存；大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購于北京天根生物科技公司。

1.1.2 實驗動物 6周齡雌性BALB/c小鼠（SPF級）購自上海斯萊克實驗動物中心

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、Ex Taq 酶、T4 DNA 連接酶、小型質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA 純化試劑盒均購自TaKaRa 公司；Ni-NTA His●Bind 樹脂及色譜柱購自Novagen公司；核酸Marker、His標(biāo)簽抗體購自北京天根生物科技有限公司；蛋白Marker購自上海麥約爾生物公司；Goat anti-Mouse IgG Antibody（IRDye800CW）抗體購自上海儀濤生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank的SjPDIA3基因（登錄號：FN320610.1）序列設(shè)計引物，上游引物加入BamHⅠ酶切位點，下游引物加入XhoⅠ酶切位點，引物由Invitrogen公司合成。上游引物：5'-GGATCCAGTGAGGTTCTCGAA- 3' ；下游引物：5'- CGCTCGAGCTATAGATCACTCT-3'。

1.2.2 SjPDIA3的擴增 以日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫為模板進行PCR擴增，擴增條件：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸2 min，32個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，參照DNA純化試劑盒操作方法對鑒定正確的產(chǎn)物進行純化回收。

1.2.3 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將PCR純化產(chǎn)物與pET28a (+) 載體質(zhì)粒分別經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物分別純化回收后16℃連接過夜，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到LB瓊脂培養(yǎng)板（Kana+10μg/mL）上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑平板上的單菌落到LB液體培養(yǎng)基（Kana+10 μg/mL）中，培養(yǎng)8～12 h，取菌液進行PCR鑒定并將陽性送上海桑尼生物公司測序，自過夜培養(yǎng)菌液抽提陽性重組質(zhì)粒后雙酶切鑒定插入片段的正確性，并將陽性質(zhì)粒命名為pET28a-SjpDIA3。

1.2.4 SjPDIA3基因的生物信息學(xué)分析 利用在線分析軟件ExPAsy Compute pI/Mw tool（http∶//web.expasy.org/compute_pi/），預(yù)測SjPDIA3蛋白及等電點大小。利用在線軟件TMHMM Server v 2.0 （http∶//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析SjPDIA3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP 4.1 Server（http∶//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測是否含有信號肽，ScanProsite tool（http∶//prosite.expasy.org/ scanprosite/）分析可能結(jié)構(gòu)。

1.2.5 SjPDIA3蛋白的表達(dá) 重組陽性質(zhì)粒pET28a-SjPDIA3轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取陽性克隆至LB培養(yǎng)基并培養(yǎng)至對數(shù)期，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)5～8 h，同時設(shè)未誘導(dǎo)組為對照。分別取誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)菌液10 800×g離心2 min，棄上清，PBS重懸菌體后與2×SDS PAGE loading bufffer等體積混勻，沸水浴微波煮沸5 min，12%的聚丙酰胺凝膠進行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后分析結(jié)果并拍照保存。

1.2.6 重組蛋白的可溶性分析 將陽性克隆表達(dá)菌大批量誘導(dǎo)培養(yǎng)后，菌液以10 000×g離心10 min，棄上清，按每100 mL培養(yǎng)基所得菌體加入1×結(jié)合緩沖液20 mL重懸菌體，反復(fù)凍融3次。超聲裂解菌體至菌液透亮不粘，取超聲后的菌液1 mL，10 800×g離心10 min，沉淀用約1 mL脲素（8 mol/L）溶解，分別取上清及沉淀按前述方法制樣，蛋白電泳鑒定該蛋白分子可溶性表達(dá)情況。

1.2.7 重組蛋白的純化和鑒定 將超聲菌液以16 000×g離心30 min，上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾進一步去除不溶成分，得到的上清按照His柱層析純化蛋白手冊進行分離純化，收集的含目的蛋白的洗脫樣品經(jīng)透析、濃縮后進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后分析。純化蛋白SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉4～8 h，以感染日本血吸蟲42日齡的小鼠陽性血清為一抗，4℃作用過夜；PBST洗3次，Goat anti-Mouse IgG Antibody （IRDye800CW）為二抗，室溫孵育45 min，PBST洗2次，PBS洗2次，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)拍照分析。

1.2.8 SjPDIA3抗血清制備 將濃縮SjPDIA3蛋白用BCA法測其濃度后，與206佐劑以46∶54比例充分混勻后皮下多點免疫6～8 周齡雌性BALB/c小鼠，首免100 μg/只，第二次免疫和三次免疫免蛋白濃度減半，免疫間隔為2 w，三免后d6眼眶采血分離血清。1.2.9 SjPDIA3蛋白免疫原性分析 Western blot檢測多抗血清特異性，分析重組蛋白的免疫原性。制備重組SjPDIA3蛋白及蟲體蛋白樣品，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，抗SjPDIA3多抗血清和His標(biāo)簽抗體分別為一抗，其他操作同1.2.7。

2 結(jié)果

2.1 SjPDIA3基因的克隆和重組載體鑒定以蟲卵cDNA為模扳進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳得到大小約為1482 bp（圖1 A）的序列，符合預(yù)期結(jié)果。該基因片段與pET28a (+) 載體的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，核酸電泳鑒定（圖1 B），載體大小約為5369 bp，目的片段約為1482 bp，證明重組載體建成功。

圖1 SjPDIA3基因的PCR擴增(A)和重組質(zhì)粒pET-28a-SjPDIA3的酶切鑒定(B)Fig.1 Amplifi cation of SjPDIA3 gene(A) and verifi cation of recombinant plasmid by enzyme digestion(B)

2.2 SjPDIA3基因生物信息學(xué)分析ExPAsy Compute pI/Mw tool分析結(jié)果顯示：SjPDIA3基因編碼493個氨基酸，預(yù)計分子量大小55.67 kDa，等電點7.12；ScanProsite 分析顯示SjPDIA3序列中有兩個含氧化還原催化位點的硫氧還原蛋白結(jié)構(gòu)域；SignalP4.1 Server在線分析顯示SjPDIA3分子的可知信號肽序列：MFVRRALKMLWLSPFLLLFAFATC；TMHMM Server v 2.0分析顯示SjPDIA3分子無跨膜結(jié)構(gòu)。

2.3 SjPDIA3 蛋白的表達(dá)分析將重組質(zhì)粒pET28a-SjPDIA3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定得到大小約為55 kDa的重組蛋白（圖2 A），符合預(yù)期值，而對照組無該條帶?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明融合蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中（圖2 B）。

圖2 SDS-PAGE分析pET-28a-SjPDIA3重組蛋白的表達(dá)(A)和可溶性(B)分析Fig.2 The expression and solubility analysis of recombinant protein pET-28a-SjPDIA3 by SDS-PAGE

2.4 SjPDIA3重組蛋白的純化和鑒定His親和層析柱純化融合蛋白，Western blot分析融合蛋白能否被感染日本血吸蟲42 d的小鼠陽性血清識別。結(jié)果表明（圖3A）在55 kDa處有特異性條帶，說明重組蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，且該蛋白可被小鼠陽性血清識別（圖3B），表明其具有良好的反應(yīng)原性。

2.5 SjPDIA3重組蛋白免疫原性鑒定純化蛋白免疫小鼠后得到SjPDIA3多抗血清， Western blot結(jié)果顯示，SjPDIA3多抗血清可特異性識別55 kDa的蟲體蛋白（圖4），表明SjPDIA3重組蛋白具有較好的免疫原性。

3 討論

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）是一類多功能蛋白，主要存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中。PDIA3是PDI家族的一員，能夠催化二硫鍵的氧化還原異構(gòu)反應(yīng)[6]，研究表明，腫瘤細(xì)胞或凋亡細(xì)胞經(jīng)某些藥物或紫外照射等處理后，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的PDIA3與鈣網(wǎng)織蛋白（calreticulin, CRT）可通過蛋白與蛋白間的交互作用形成分子復(fù)合物，二者協(xié)同自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔轉(zhuǎn)至質(zhì)膜表面發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)作用[5]。除了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布以外，PDIA3也定位及作用于其他部位，如細(xì)胞質(zhì)[7]、細(xì)胞核[8,9]。此外，在多種哺乳動物細(xì)胞核內(nèi)，PDIA3在紫外照射或甲醛等處理后可與DNA形成復(fù)合物，PDIA3與高遷移率族蛋白B1/B2（HMGB1/ HMGB2）形成一個復(fù)雜的蛋白核復(fù)合物，識別受損的DNA[6]。此外，研究表明癌癥細(xì)胞中的HMGB1、HMGB2和PDIA3是影響抗代謝藥物反應(yīng)重要決定因素[10]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在RAV模型中，SjCRT、SjHMGB1和SjHSP70能夠活化宿主樹突狀細(xì)胞（DC）[3,4]，形成引發(fā)和驅(qū)使保護性先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的環(huán)境。故我們推測，在RAV模型中，SjPDIA3可能在SjCRT由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜過程中發(fā)揮分子伴侶的作用，此外，它在SjHMGB1的遷移過程也可能具有相關(guān)功能。

圖3 SjPDIA3重組蛋白的純化（A）和Western blot鑒定（B）Fig.3 The purifi cation and identifi cation of recombinant protein SjPDIA3

圖4 SjPDIA3融合蛋白免疫小鼠獲得的抗血清的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of SjPDIA3 antiserum from mouse infected by fusion protein

PDIA3目前的研究多集中其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的相關(guān)功能，其生物學(xué)功能主要有參與糖蛋白的正確折疊及質(zhì)量控制[11,12]，構(gòu)成主要組織相容性復(fù)合物的肽運載復(fù)合體[13,14]，鑒于PDIA3與（CRT）緊密結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，故其與CRT介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫機制的研究也緊密相關(guān)[4]，此外，Natalia 等[15]發(fā)現(xiàn)PDIA3與HMGB1/2在癌癥的治療過程中，可觸發(fā)相關(guān)細(xì)胞反應(yīng)以應(yīng)對化療引起的DNA損傷。研究發(fā)現(xiàn)，PDIA3也是一種應(yīng)激相關(guān)蛋白，在急性脊椎缺血再灌注（spinal cord ischemia reperfusioninjury，SCIRI） 損傷過程中呈現(xiàn)差異性分布的特點[16]。

目前，對PDIA3分子的相關(guān)研究主要集中于哺乳動物的精卵融合及腫瘤免疫機制的研究等方面，其在日本血吸蟲中的相關(guān)研究幾乎處于空白狀態(tài)。本課題組的研究發(fā)現(xiàn)SjCRT、SjHMGB1等應(yīng)急分子可能與RAV誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高保護性效應(yīng)機制有關(guān)[9,17]，初步推斷，輻照可引起這類應(yīng)急分子的遷移，進而遷移后發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)合PDIA3與CRT及HMGB1之間的關(guān)系，我們推測，在RAV模型中，SjPDIA3可協(xié)助SjCRT這類應(yīng)急分子胞內(nèi)至胞外的遷移，從而增強凋亡或壞死蟲體細(xì)胞的免疫原性。本研究以日本血吸蟲cDNA文庫為模板，利用PCR技術(shù)擴增SjPDIA3全長序列，并在原核表達(dá)載體pET28a (+) 中成功表達(dá)，利用重組蛋白SjPDIA3制備得到特異性良好的多克隆抗體血清，為我們后續(xù)研究SjPDIA3與SjCRT在RA血吸蟲中的共定位問題提供材料。

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PROKARYOTIC EXPRESSION OF PDIA3 PROTEIN OF SCHISTOSOMA JAPONICUM AND PREPARATION OF POLYCLONAL ANTIBODIES

LIU Qun1,2, DUAN Ming-ming2, YUAN Chun-xiu2, LI Dan-dan1,2, GE Cheng1,2, MA Li-zhen2, FENG Xin-gang2
(1.College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 2.Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The objective of the present study was to express recombinant SjPDIA3 protein in E.coli and prepare polyclonal antibodies.The PDIA3 gene was amplifi ed in PCR using the genome of Schistosoma japonicum as a template.The PCR products obtained were inserted into prokaryotic expression vector pET28a(+).The recombinant plasmid pET28a(+)-SjPDIA3 was transformed into E.coli BL21(DE3).Subsequently, SjPDIA3 protein was expressed with induction of IPTG and purifi ed using NI-NTA resin.The BALB/c mice were immunized with recombinant SjPDIA3 protein to generate polyclonal antibodies.The results showed that a cDNA of 1482 bp was amplifi ed.Bioinformatics analysis determined that the full-length ORF was 1482 bp encoding 493 amino acids and SjPDIA3 protein had a thiol-disulfi de oxidoreductase domain and a signal peptide with no transmembrane peptide.Western blot demonstrated prokaryotic expression of the recombinant SjPDIA3 protein with molecular mass of 55 kDa and its effi cient antigenicity and immunogenicity as expected.

Schistosoma japonicum; SjPDIA3; prokaryotic expression; polyclonal antibody

S852.735

：A

：1674-6422（2015）01-0033-06

2014-04-17

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2013JB15)；動物血吸蟲病創(chuàng)新團隊基金

劉群，女，碩士研究生，動物學(xué)專業(yè)

馮新港，E-mail∶ boming666@163.com