郝桂英，楊應(yīng)東，楊光友

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，雅安625014；2.西昌學(xué)院，西昌615013；3.四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院畜牧水產(chǎn)所，攀枝花617061）

·簡(jiǎn)報(bào)·

四川省山羊多頭蚴線粒體cox2基因序列測(cè)定及種系發(fā)育分析

郝桂英1,2，楊應(yīng)東3，楊光友1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，雅安625014；2.西昌學(xué)院，西昌615013；3.四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院畜牧水產(chǎn)所，攀枝花617061）

應(yīng)用線粒體細(xì)胞色素氧化酶第Ⅱ亞基（cox2）基因作為分子標(biāo)記，對(duì)四川省12個(gè)山羊源多頭蚴樣品的cox2基因部分序列（pcox2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析其種內(nèi)變異并重建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。序列分析結(jié)果顯示所獲得的pcox2序列長(zhǎng)度為531 bp，共檢測(cè)到8個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為0～1.3%?；趐cox2序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示多頭蚴四川分離株與已知多頭帶絳蟲(chóng)位于同一分支，且腦源和肌間多頭蚴聚在一起，均為多頭帶絳蟲(chóng)。結(jié)果表明，多頭蚴cox2基因種內(nèi)存在一定的遺傳差異，但種內(nèi)相對(duì)保守，與帶屬其他絳蟲(chóng)種間差異較大，故可作為多頭帶絳蟲(chóng)種間遺傳變異研究的分子標(biāo)記。這一研究結(jié)果也為山羊多頭蚴病的分子診斷奠定了基礎(chǔ)。

多頭蚴；山羊；cox2基因；種系發(fā)育關(guān)系

腦多頭蚴（Coenurus cerebralis）又稱腦包蟲(chóng)，是多頭帶絳蟲(chóng)（Taenia multiceps）的中絳期幼蟲(chóng)，主要寄生于綿羊、山羊、黃牛、牦牛、水牛、駱駝、鹿、羚羊、羚牛等家養(yǎng)及野生有蹄類草食動(dòng)物的大腦，偶有寄生于脊髓、肌間和腹腔[1-3]，引起動(dòng)物的腦多頭蚴病，人也可感染[4]。腦多頭蚴呈世界性分布，在中國(guó)許多省、市均有報(bào)道，尤以西北、華北、東北等廣大牧區(qū)常見(jiàn)[5]。

目前，絳蟲(chóng)分類主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)、生活史、宿主范圍、流行病學(xué)調(diào)查、生態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)分析等方面進(jìn)行鑒定和區(qū)分。但傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法對(duì)形態(tài)相近的蟲(chóng)種難以鑒別。

另外，隨著人類活動(dòng)的干擾，部分絳蟲(chóng)的宿主范圍和地理分布呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì)，這對(duì)根據(jù)已有生活史、宿主范圍、流行病學(xué)調(diào)查、生態(tài)學(xué)資料進(jìn)行鑒定起到很大的干擾。隨著分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，絳蟲(chóng)種類的鑒定越來(lái)越趨向于利用基因間的差異。絳蟲(chóng)的基因組不會(huì)因宿主、環(huán)境、不同發(fā)育階段以及翻譯后修飾等因素的誘導(dǎo)而發(fā)生變異[6]。其中線粒體基因由于其具有高突變率、不同種間差異較大等特征，可以從分子水平上對(duì)種內(nèi)和種間的遺傳變異進(jìn)行分析，已成為絳蟲(chóng)種類鑒定的熱點(diǎn)[7]。

本研究應(yīng)用線粒體DNA（mtDNA）中cox2基因作為分子標(biāo)記，對(duì)我國(guó)四川省12個(gè)多頭蚴樣品種內(nèi)變異進(jìn)行了分析，并探討了其與其他帶屬絳蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從而明確cox2基因能否成為理想的種間遺傳標(biāo)記，同時(shí)為山羊多頭蚴病的分子診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 多頭蚴的采集12個(gè)多頭蚴樣品分別采自四川省攀枝花市、雅安市和成都市金堂縣。將采集的多頭蚴外層結(jié)締組織膜剝離得到原頭蚴，用滅菌生理鹽水清洗3次，分別編號(hào)（見(jiàn)表1），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 部分帶屬絳蟲(chóng)的線粒體cox2基因序列信息Table1 Sequence information of mitochondrial cox2 gene partial Taenia

1.2 基因組DNA的提取用剪刀剪取各樣品的原頭蚴約20 mg于研缽中研碎，加入DNA裂解液和蛋白酶K消化過(guò)夜后，用酚/氯仿法[8]提取多頭蚴基因組DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 pcox2序列的擴(kuò)增、純化與序列測(cè)定根據(jù)GenBank上已收錄的多頭帶絳蟲(chóng)線粒體全基因組（登錄號(hào)：NC_012894）的cox2基因全序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物。pcox2 P1：5′-AAGTTGGTTACTGGGGAGA-3′，pcox2 P2：5′-CCACATCAACAACCTCAAT-3′。引物序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。擴(kuò)增體系為50 μL：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物P1、P2（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 2 μL，滅菌ddH2O 19 μL。同時(shí)，以ddH2O代替模板DNA作空白對(duì)照。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，42℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其大小、純度及亮度。

使用柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行DNA的回收純化，回收產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行正反雙向測(cè)序。

1.4 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析從GenBank檢索到已收錄的7種其他帶屬絳蟲(chóng)的線粒體全基因組，下載其相應(yīng)的pcox2基因序列（表1），然后用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對(duì)，MEGA 5.0軟件分析堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比率，基于K2P模型計(jì)算遺傳距離。用DNAStar 中的MegAlign程序進(jìn)行序列同源性分析。用DNASP 4.0軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（number of polymorphic sites，S）、單倍型數(shù)（haplotypes，H）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）、單倍型多樣性（haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，K）。

以帶科棘球?qū)俚募?xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus granulosus）（GenBank登錄號(hào)：NC_008075）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群，采用K2P模型，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ樹(shù)，并進(jìn)行重復(fù)1000次的自舉檢驗(yàn)（bootstrap test）。同時(shí)以Mrbayes3.1.2軟件構(gòu)建貝葉斯樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 pcox2序列組成和相似性對(duì)12個(gè)多頭蚴樣品的pcox2基因序列進(jìn)行排序分析后，去掉引物序列，得到531 bp的基因片段（占全長(zhǎng)的92%）。pcox2序列沒(méi)有堿基插入/缺失，其中保守位點(diǎn)523個(gè)，變異位點(diǎn)8個(gè)（占1.5%），包括7個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和1個(gè)單變異位點(diǎn)。變異僅發(fā)生在密碼子的第3位和第1位，其中第3位占87.5%。A、T、C、G堿基的平均含量分別為25.8 %、42.2 %、10.6%、21.4%，表現(xiàn)出明顯的AT偏倚，這與賈萬(wàn)忠等[9]報(bào)道的結(jié)果相似，這可能由序列變異或選擇壓力造成的。序列中轉(zhuǎn)換多于顛換，轉(zhuǎn)換/顛換（R）為2.382。其中T與C、A與G間的轉(zhuǎn)換均為3個(gè)，T與G、C與G間的顛換均為1個(gè)。

12個(gè)多頭蚴樣品的pcox2序列的核苷酸相似性為98.7%～100%，共得到4條不同的序列，序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1。測(cè)序序列與已知多頭帶絳蟲(chóng)的同源基因核苷酸相似性為98.1%～98.9%，與其他帶屬絳蟲(chóng)的cox2同源基因序列相似性低于92.1%。本研究測(cè)定的12個(gè)多頭蚴樣品pcox2序列的堿基變異率為0～1.3%，與其他帶屬絳蟲(chóng)同源基因的變異率大于8.6%，由此可見(jiàn)多頭蚴cox2基因片段的種內(nèi)變異遠(yuǎn)小于種間變異，其中多頭帶絳蟲(chóng)與牛帶絳蟲(chóng)、亞洲帶絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)的相似性高于泡狀帶絳蟲(chóng)、豆?fàn)顜Ы{蟲(chóng)、肥頭絳蟲(chóng)和帶狀帶絳蟲(chóng)，與Gasser等[10]報(bào)道的結(jié)果一致。

2.2 多頭蚴地理種群的遺傳多樣性對(duì)12個(gè)多頭蚴樣品的pcox2基因進(jìn)行單倍型分析，共檢測(cè)出4個(gè)單倍型，即H1～H4，其中雅安樣品和攀枝花樣品共享單倍型H2，雅安僅有此單倍型。在4個(gè)單倍型出現(xiàn)頻率最高的是H2，占全部個(gè)體的50%。計(jì)算12個(gè)樣品的單倍型多樣性（Hd）為0.712，核苷酸多樣性（Pi）為0.00551，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)8個(gè)，平均核苷酸差異（K）為2.924，遺傳距離為0.002～0.008（平均0.002），與已知多頭帶絳蟲(chóng)的遺傳距離為0.017～0.032，與其他帶屬絳蟲(chóng)的遺傳距離大于0.032。腦源、肌肉源種群內(nèi)單倍型間遺傳距離分別為0.002～0.008、0.000～0.004，攀枝花與雅安種群間遺傳距離為0.002。各種群的遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表2。

衡量一個(gè)種群線粒體遺傳變異有兩個(gè)重要的指標(biāo)：?jiǎn)伪缎烷g的平均遺傳距離和核苷酸多樣性。一般而言，單倍型間的核苷酸多樣性（Pi）是衡量群體內(nèi)遺傳多樣性的重要指標(biāo)之一。Pi值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富[11]。由于核苷酸多樣性考慮了各種單倍型在群體中所占的比例，因此反映一個(gè)群體的線粒體多態(tài)程度是比單純的平均遺傳距離更準(zhǔn)確[12]。對(duì)于大多數(shù)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，Pi值在0.01以上時(shí)被認(rèn)為變異較大[13]。本研究結(jié)果顯示，多頭蚴單倍型間的pcox2序列Pi為0.00551，由此可見(jiàn)基于pcox2序列的多頭蚴各種群間的遺傳多樣性較低。

圖1 多頭蚴分離株cox2基因片段序列比對(duì)及核苷酸變異位點(diǎn)Fig.1 Sequences alignment of cox2 gene fragment and nucleotide variation sites of Coenurus isolates

表2 基于cox2基因序列的多頭蚴種群遺傳多樣性Table2 The genetic diversity based on cox2 gene in the populations of Coenurus

不同群體間的遺傳距離反映其群體間遺傳組成分化的程度。就cox2基因片段而言，攀枝花種群的分化程度（平均遺傳距離為0.004）高于雅安種群（平均遺傳距離為0）。且雅安樣品間cox2基因序列沒(méi)有任何變異，單倍型多樣性和核苷酸多樣性均為0，這可能是由于雅安種群的多頭蚴均采自一養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的同一群山羊體內(nèi)，而攀枝花種群的多頭蚴均采自不同養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的羊。另外，絳蟲(chóng)是雌雄同體，可通過(guò)有性生殖階段的自體孤立、自體受精的生殖方式、株間不會(huì)雜交等機(jī)理維持其同種狀態(tài)（同株遺傳性）[14]，它們的后代基因可能完全一致。這個(gè)特征對(duì)絳蟲(chóng)種群的基因結(jié)構(gòu)具有非常重要的影響。如自體受精可能降低種群內(nèi)的基因變異，并增加種群間的分化[15]。

2.3 基于pcox2基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建的貝葉斯樹(shù)和NJ樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（僅列出NJ樹(shù)，見(jiàn)圖2）。構(gòu)建的NJ樹(shù)顯示12個(gè)測(cè)序株與多頭帶絳蟲(chóng)已知株構(gòu)成1個(gè)分支，能與豬帶絳蟲(chóng)（T.solium）、牛帶絳蟲(chóng)（T.saginata）、亞洲帶絳蟲(chóng)（T.asiatica）、豆?fàn)顜Ы{蟲(chóng)（T.pisiformis）、泡狀帶絳蟲(chóng)（T.hydatigena）、肥頭帶絳蟲(chóng)（T.crassiceps）、帶狀帶絳蟲(chóng)（T.taeniaeformis）很好地鑒別，且多頭帶絳蟲(chóng)與豬帶絳蟲(chóng)的親緣關(guān)系最近。

圖2 基于pcox2序列NJ法構(gòu)建的多頭蚴系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（支持率標(biāo)注在分支上）Fig.2 Phylogenetic tree of Coenurus based on pcox2 sequence by using neighbor-joining analysis ( Numbers on the tree represent the supporting value )

通常帶科絳蟲(chóng)病的診斷常采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法和ELISA等免疫學(xué)診斷方法，但這些方法都有一定的缺陷。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定需要采集完整的蟲(chóng)體，并且對(duì)頭節(jié)和不同發(fā)育階段的節(jié)片進(jìn)行固定、染色、封片等繁瑣的操作后觀察進(jìn)行種類鑒定。而ELISA等免疫學(xué)診斷方法所用抗原局限于來(lái)源有限的天然抗原，且常因存在交叉抗原而假陽(yáng)性高，在臨床應(yīng)用中受到限制[16,17]。近年興起的分子方法對(duì)帶科絳蟲(chóng)的鑒別、系統(tǒng)分類學(xué)、診斷、流行病學(xué)、傳播方式、種群分析、耐藥性研究和疫苗的發(fā)展都有非常重要的影響[18]。

目前用于多頭帶絳蟲(chóng)的分子標(biāo)記主要有cox1[19]、nad1[20]、nad4[21]、Cytb[22]、12S rRNA[23]等，但cox2基因能否作為研究多頭帶絳蟲(chóng)分離株種內(nèi)變異的分子標(biāo)記，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。本研究的結(jié)果顯示多頭蚴cox2基因種內(nèi)存在一定的遺傳差異，但相對(duì)保守，與帶屬其他絳蟲(chóng)種間差異較大，故可作為多頭帶絳蟲(chóng)種間遺傳變異研究的分子標(biāo)記。

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SEQUENCING AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF MITOCHONDRIAL COX2 GENE OF COENURUS IN GOATS IN SICHUAN PROVINCE

HAO Gui-ying1,2, YANG Ying-dong3, YANG Guang-you1
(1.College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China; 2.Xichang College, Xichang 615013, China; 3.Animal Science and Fisheries Research Institute, Panzhihua Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Panzhihua 617061, China)

The mitochondrial cytochrome coxidase subunit 2 (cox2) gene was used as a molecular marker to identify the intraspecies variation and reconstruct their phylogenetic relationship of 12 Coenurus isolates collected from goats in Sichuan province.Sequence analysis indicated that the cox2 gene fragment was 531 bp containing a total of 8 nucleotide variant sites.The Phylogenetic tree based on the cox2 sequence showed that all Taeina multiceps isolates clustered together while cerebral and intramuscular specimens grouped together, indicating that all isolates were T.multiceps.There was no signifi cant variation in the cox2 gene sequences within Coenurus although interspecies differences were obvious in Taenia.Therefore, cox2 gene was suitable as a molecular marker to study the intraspecifi c variation of T.multiceps.The results of the present study paid a solid foundation for molecular diagnosis of coenurosis.

Coenurus; goats; cox2 gene; phylogenetic relationship

S852.734

：B

：1674-6422（2015）01-0054-06

2014-08-19

教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT0848）

郝桂英，女，博士，主要從事分子寄生蟲(chóng)學(xué)研究

楊光友，E-mail∶guangyou1963@aliyun.com