陳紅梅，萬春和，程龍飛，傅光華，施少華，傅秋玲，張丹青，黃 瑜

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013）

·簡報·

一株雛鵝呼腸孤病毒的分離與鑒定

陳紅梅，萬春和，程龍飛，傅光華，施少華，傅秋玲，張丹青，黃 瑜

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013）

2013年福建省某鵝場發(fā)生一起以肝臟和脾臟均有灰白壞死點（肝白點）為典型病變特征的急性傳染病。本研究利用10日齡非免疫番鴨胚，從病死雛鵝肝臟中分離到1株病毒。病毒分離株沒有血凝活性，其ELD50為10-3.25/0.2 mL，可被鵝呼腸孤病毒高免血清特異性中和。利用鵝呼腸孤病毒特異性檢測引物對FJ-06株病毒尿囊液進(jìn)行RT-PCR檢測，可擴(kuò)增到約572 bp特異性目的條帶。將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，Blast分析表明，克隆的基因片段為鵝呼腸孤病毒δC蛋白基因片段。結(jié)果表明成功分離到1株鵝呼腸孤病毒。

鵝呼腸孤病毒；分離；鑒定

鵝呼腸孤病毒（Goose reovirus，GRV）感染呈世界分布，該病原最早由Fahey和Crawley于1954年眾患有慢性呼吸道的雞呼吸道內(nèi)分離出[1]。隨后學(xué)者們從野鴨[2]、北京鴨[3]、觀賞鴨[4]和番鴨[5]等不同品種鴨體分離到呼腸孤病毒。王永坤等[6]2002年首次從表現(xiàn)為典型出血性壞死的病死鵝肚臟中分離到鵝呼腸孤病毒。2003年，Palya等[7]報道呼腸孤病毒可導(dǎo)致鵝關(guān)節(jié)炎，并詳細(xì)介紹了患鵝的發(fā)病特點。是屬于呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬II亞群[8]，主要侵害3周齡以內(nèi)雛鵝，被感染雛鵝主要的病變特征是肝脾壞死，并伴有腎臟壞死，心內(nèi)膜部分出血。2013 年11月，福建省某鵝場23日齡雛鵝出現(xiàn)精神沉郁、行動遲緩、蹲伏或側(cè)臥，剖檢病變?yōu)楦闻K與脾臟均有大量壞死點。采集1份疑似感染GRV的病鵝肝臟，接種番鴨胚后獲得1株病毒（命名為FJ-06），并使用RT-PCR檢測方法對其進(jìn)行鑒定，經(jīng)克隆測序表明成功分離到1株鵝呼腸孤病毒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑Trizol Reagent 購自Life Technologies公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、HPRI、dNTPs (2.5 mmol/L）和pMD18-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；Go Taq Master Green Mix 購自Promega 公司；瓊脂糖凝膠回收小量試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞自制；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物和實驗胚3日齡健康雛鵝購自福建省長樂市某非免疫養(yǎng)殖場，10日齡健康番鴨胚購自福建省莆田市某非免疫種鴨場。

1.3 病毒分離采集病死鵝肝臟剪碎后，按1∶5比例加入滅菌生理鹽水研磨成乳狀，反復(fù)凍融3 次，12 000×g離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。將無菌的濾液經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡健康番鴨胚，每枚接種0.5 mL，棄去24 h內(nèi)死亡胚，連續(xù)觀察7 d。收獲番鴨胚尿囊液后菌檢，確定無菌后經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡健康番鴨胚，連續(xù)傳代3次，收獲的番鴨胚尿囊液作為種毒（命名為FJ-06株），檢查無菌后分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒分離株的部分生物學(xué)特性

1.4.1 血凝活性 分別配制1%的雞和豚鼠紅細(xì)胞懸液，取100 μL番鴨胚尿囊液，按微量血凝試驗方法分別測定FJ-06株病毒的血凝活性。

1.4.2 病毒對番鴨胚的ELD50測定 將FJ-06株病毒液用滅菌PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋后備用。取10-2～10-7共6個稀釋度，分別接種于10日齡番鴨胚尿囊腔中，每個稀釋度接種5個番鴨胚，每胚0.2 mL。連續(xù)觀察7 d，每天記錄死亡情況。按Reed-Muench法計算病毒對番鴨胚的ELD50。

1.4.3 血清中和實驗 1∶10稀釋鵝呼腸孤滅活疫苗免疫健康鵝獲得的高免血清（自制），與5 mL 100 ELD50等體積混合后，37℃作用2 h。接種10日齡健康番鴨胚，每枚0.2 mL，接種5枚。連續(xù)觀察7 d，記錄死亡情況。同時設(shè)立尿囊液組、高免血清組和PBS對照組。

1.5 病毒的分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 病毒核酸提取 取300 μL蝕斑克隆株鴨胚液毒，加入700 μL Trizol Reagent RNA 提取液，按照說明書提取病毒RNA。再按照反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 病毒的分子生物學(xué)鑒定 參照GenBank上已發(fā)表的番鴨呼腸孤毒δC蛋白序列，設(shè)計1對引物：上游引物：5'-GAATCGTGGTCTAGCGAC-3'；下游引物5'-CTCGCATCTGCTGATCATAATTA CC-3'，其理論擴(kuò)增長度為572 bp。用所設(shè)計的特異性引物對1.5.1制備的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL：2×Go Taq Master Green Mix 25 μL、上下游引物（20 μm/ mL）各1 μL、cDNA模板1 μL，補(bǔ)充滅菌ddH2O至總體積50 μL。反應(yīng)程序94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72℃延伸 10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，在1.0 %瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒血凝活性FJ-06株病毒對1%的雞和豚鼠紅細(xì)胞均無肉眼可見的凝集作用。

2.2 病毒ELD50測定病毒液以10-2稀釋度接種鴨胚死亡5枚，10-3稀釋度接種鴨胚死亡3枚，10-4稀釋度接種鴨胚死亡1枚，10-5稀釋度至10-7稀釋度接種鴨胚沒有死亡。根據(jù)Reed-Muench法計算，病毒ELD50為10-3.25/0.2 mL。

2.3 病毒血清中和實驗從血清中和實驗可以看出，F(xiàn)J-06株病毒稀釋液和鵝呼腸孤病毒高免血清中和后，接種番鴨胚均未見死亡。尿囊液組接組種5枚番鴨胚均死亡，而高免血清組和PBS對照組均未見死亡。尿囊液接種死亡番鴨胚體肝臟有明顯的白色壞死點。

2.4 病毒的鑒定用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小約572 bp (見圖1)。

圖1 RT-PCR檢測FJ-06株的δC基因序列結(jié)果Fig.1 RT-PCR results of δC gene of FJ-06 strain

2.5 序列測定與分析通過DNAStar 軟件對FJ-06株δC蛋白基因序列與GenBank上發(fā)表的8株禽源呼腸孤病毒株進(jìn)行核苷酸序列的同源性比對（見表1）。結(jié)果表明，F(xiàn)J-06分離毒株的序列與水禽源的呼腸孤病毒的同源型很高，為93.0%～97.4%，而與雞源的呼腸孤病毒同源性很低，僅有74.4%。從遺傳進(jìn)化圖（圖2）上可清晰地看到，雞源和水禽源的呼腸孤病毒各占一支，F(xiàn)J-06株與水禽源的呼腸孤病毒的遺傳關(guān)系很近，而與雞源的呼腸孤病毒遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，由此可進(jìn)一步推斷出：所分離的FJ-06株為鵝呼腸孤病毒。

表1 FJ-06株δC基因序列與部分禽源呼腸孤病毒核苷酸同源性比較Table1 Homology analysis of δC gene nucleotides of FJ-o6 strain and other Avian Reovirus strains

圖2 禽源呼腸孤病毒δC基因的遺傳進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree based onδC gene of Avian Reovirus

參考文獻(xiàn)

[1] Dobson K N, Glisson J R.Economic impact of a documented case of reovirus infection in broiler breeders[J].Avian Dis, 1992, 36(3)∶ 788-791.

[2] Jones R C.Avian reovirus infections[J].Rev Sci Tech, 2000, 19(2)∶ 614-625.

[3] Guo Z Y, Giambrone J J, Liu Z.Effect of in ovo administered reovirus vaccines on immune responses of specific-pathogen-free chickens[J].Avian Dis, 48(1)∶224-228.

[4] Engstrom B E, Fossum O, Luthman M.Blue wing disease of chickens∶ Experimental infection with Swedish isolate of chicken anemia agment and an avian reovirus[J].Avian Pathol, 1988, 17(1)∶ 33-50.

[5] 吳寶成, 陳家祥, 姚金水, 等.番鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2001, 30(2)∶ 227-230.

[6] 王永坤, 周繼宏, 嚴(yán)維巍, 等.鵝出血性壞死性肝炎的初步研究[J].中國家禽, 2002, 24(18)∶ 9-11.

[7] Palya V, Glavits R, Dobos-Kovacs M, et al.Reovirus identified as cause of disease in young geese [J].Avian Pathol, 2003, 32(2)∶ 129-138.

[8] Saif Y M.禽病學(xué)[M].蘇敬良, 高福, 索勛, 譯.12版.北京∶ 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2012∶ 355-371.

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF A GOSLING REOVIRUS

CHEN Hong-mei, WAN Chun-he, CHENG Long-fei, FU Guang-hua, SHI Shao-hua, FU Qiu-ling, ZHANG Dan-qing, HUANG Yu (Fujian Animal Disease Control Technology Development Center, Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Science, Fuzhou 350013, China)

An acute infectious disease occurred in a gosling fl ock in 2013 in Fujian Province.Gray necrotic spots were observed in livers and spleens.Livers collected from dead goslings were homologized and inoculated into 10-day-old Muscovy duck embryos for virus isolation.The isolated virus had no hemagglutinating activity for chicken and guinea pig red blood cells.When duck embryos were inoculated with the isolated virus, the ELD50was determined to be 10-3.25/0.2 mL.In addition, the isolated virus was neutralized with the hyper-immune serum from vaccinated geese.Viral RNA was amplifi ed from the isolated virus using RT-PCR with specifi c target primers.A fragment of 572 bp was obtained, then sequenced and analyzed.The results confi rmed that the isolated virus was a reovirus.

Goose reovirus; isolation; identifi cation

S852.659.4

：B

：1674-6422（2015）01-0047-04

2014-09-02

國家公益性行業(yè)科研專項（201003012）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-43）

陳紅梅，碩士，助理研究員，主要從事畜禽傳染病研究

黃瑜， E-mail：huangyu_815@163.com