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硅藻土提取尿中士的寧和馬錢子堿LC-MS/MS測定法

吳玉紅1，宋鵬2，邵博3

（1.重慶警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系，重慶401331；2.上海市國內(nèi)安全保衛(wèi)局，上海200042；3.黑龍江省公安廳刑事技術(shù)總隊，黑龍江哈爾濱150008）

【摘要】用硅藻土提取尿中士的寧和馬錢子堿，然后采用LC-MS/MS測定的方法檢測。士的寧和馬錢子堿檢出限分別為1.5ng/ mL和1.2ng/ mL；提取率分別為98.4%，96.8%；線性范圍0.01～10 g/mL。可作為法醫(yī)毒物常規(guī)檢驗。

【關(guān)鍵詞】馬錢子堿；士的寧；尿；硅藻土；LC-MS/MS

士的寧和馬錢子堿共存于馬錢屬的許多植物中，是一種常見的生物堿。士的寧是一種中樞神經(jīng)興奮劑，醫(yī)療中常用于治療弱視癥、癱瘓及再生障礙性貧尿。馬錢子堿常用于治療中風(fēng)引起的神經(jīng)麻痹和作為鍵胃藥。常見使用不當或服藥過量引起的中毒或死亡。

目前，對生物檢材中士的寧和馬錢子堿的檢驗方法，有紫外導(dǎo)數(shù)光譜法[1]、氣相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[2]和高效液相色譜法[3]，以氣相色譜－氣質(zhì)聯(lián)用法最為常見。由于兩種生物堿分子量相對較大，不易汽化，應(yīng)用氣相色譜和氣相色譜－氣質(zhì)聯(lián)用法需采用較高的柱溫，否則，靈敏度低，易造成柱溫流失。采用高效液相色譜法又易拖尾。為此，采用硅藻土提取方法和高效液相色譜－二級質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)，方法簡單快速、提取率高、靈敏度高。

一、實驗部分

（一）儀器、材料及試劑

LXQ液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher公司）。

人尿：取自近期未服藥物，健康人排泄的尿液。

士的寧、馬錢子堿：分析純，質(zhì)量符合國家藥典規(guī)定；用甲醇配制成1.0mg/mL標準溶液。

調(diào)查問卷參考“英美兩國老年癡呆預(yù)防指南”并結(jié)合青島市老年癡呆早期發(fā)病案例及其它相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上自行設(shè)計,并請相關(guān)專家對問卷內(nèi)容進行評議、修改和表面效度測定,進行預(yù)調(diào)查20名后形成正式問卷。問卷內(nèi)容分為三部分:①一般資料問卷:包括年齡、性別、社區(qū)服務(wù)中心名稱、職稱、學(xué)歷、護理工作年限、社區(qū)工作年限、是否參加過臨床工作等。②社區(qū)護士對老年癡呆預(yù)防及早期干預(yù)總體認知情況。③所在社區(qū)對老年癡呆預(yù)防及早期干預(yù)現(xiàn)狀。其中社區(qū)護士對老年癡呆預(yù)防及早期干預(yù)總體認知部分18題,老年癡呆預(yù)防及早期干預(yù)現(xiàn)狀18題。

甲醇為色譜純；乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸銨溶液、醋酸、醋酸鈉、碳酸、碳酸氫鈉等均為分析純。

（二）檢測方法

1.儀器條件

液相條件:色譜柱HyPuRiTY C18ODS（2.1mm× 150mm Column）（Thermo公司生產(chǎn)）,流速0.20mL/min，采集時間15min，進樣量10.0 L；流動相為甲醇5mmol/L:乙酸銨溶液(pH=3.0～4.0)=70:30。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離（IonSprary）-陽離子模式（ESI+）進行MRM方式檢測，碰撞能量（CE）為35.0V，噴射電壓5KV，毛細管溫度350℃。

2.提取檢測方法

取檢尿1.0mL倒入硅藻土層析柱中，用二氯甲烷洗脫，收集8.0mL洗脫溶劑，添加5.0 L1.0mg/mL內(nèi)標SKF525A，于50℃水浴濃縮至干。剩余物用1.0 mL甲醇溶解。0.45 m濾膜過濾后,取10.0 L進行LC-MS/MS分析，以內(nèi)標標準曲線法進行定量分析。

二、結(jié)果與討論

（一）工作曲線的制備

（二）硅藻土萃取條件的確定

取空白尿液1.0mL，添加100.0 g/mL混合標準工作液1.0 L。分別在pH5、pH7、pH9條件下，用乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯進行洗脫，提取率見表1。

實驗發(fā)現(xiàn)，尿中士的寧、馬錢子堿的提取受pH影響不大，用二氯甲烷作為洗脫溶劑，均能得到較好的提取效果。

（三）儀器條件的確定

1.質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵直接進樣的方式，以20.0 L/min將10.0ng/mL的士的寧、馬錢子堿標準溶液和SKF525A對照品溶液分別注入離子源中，采用儀器自動調(diào)諧的方式，獲得最優(yōu)的質(zhì)譜檢測條件，見表2。在正離子檢測方式下對它們進行一級質(zhì)譜分析，得到2種化合物的分子離子峰，然后分別對準分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析。選擇士的寧、馬錢子堿和SKF525A的檢測離子對，士的寧335.27~264.13，馬錢子堿395.58~324.16，SKF525A（內(nèi)標）354.24~281.30。

表1　尿液中士的寧、馬錢子堿在不同pH值及洗脫溶劑條件下提取率考查(n=5)

表2　士的寧、馬錢子堿的譜調(diào)諧參數(shù)

2.液相色譜條件的優(yōu)化

由于士的寧、馬錢子堿和SKF525A易溶于甲醇，選擇甲醇作為流動相之一，同時選擇水和5mmol/L乙酸銨作為流動相之二。色譜結(jié)果表明，加入乙酸銨后峰形明顯改善，提示應(yīng)選擇甲醇-5mmol/L乙酸銨作為流動相溶劑。選擇不同比例（90∶10,80∶20,70∶30,60∶40,50∶50,40∶60）的甲醇-5mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，分別觀察它們的出峰情況，結(jié)果顯示，甲醇含量減少，出峰時間過長；甲醇含量過大，峰拖尾嚴重；選擇甲醇-5mmol/L乙酸銨比例為70:30時，峰形和保留時間均較為合適。

（四）檢出限

取空白尿液1.0mL5份，按文中方法進行提取，添加內(nèi)標20ng /mL進行測定，得到空白尿色譜圖。另取尿添加藥物20ng /mL、內(nèi)標20ng /mL，同上進行提取測定，以“基線噪音”3倍的檢材藥物含量得檢出限。結(jié)果檢出限士的寧為1.5ng/ mL，馬錢子為1.2 ng/ mL。

（五）提取率實驗

取1.0mL尿液，分別添加士的寧、馬錢子堿0.1、1.0、10.0 g，按照文中方法進行提取、檢測，提取率見表3。

表3　尿中士的寧、馬錢子堿的提取率(n=5)

（六）毒性實驗

取體重2.5kg家兔1只，灌服馬錢子堿30mg，15分鐘處死，解剖取其血、尿，按本文方法測定。測值為8.7 g/mL。

三、實驗結(jié)論

在對生物檢材中的士的寧和馬錢子堿的檢驗中，需要經(jīng)提取和儀器檢測兩大環(huán)節(jié)。采用硅藻土提取，提取率高、檢出限低、去雜質(zhì)能力強、方法極為簡單快速，是目前最好的提取方法之一。采用高效液相色譜－二級質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)，相對其他檢測方法而言，靈敏度高、穩(wěn)定、準確，更適合士的寧和馬錢子堿的檢測。

【參考文獻】

[1]吳玉紅,許英鍵.尿中馬錢子堿硅藻土提取紫外三階導(dǎo)數(shù)光譜測定法研究[J].廣東公安科技,2004(4):14-16.

[2]呂霞,郭青,鐘文英.GC-MS法測定疏風(fēng)活絡(luò)丸中偽麻黃堿、麻黃堿、士的寧和馬錢子堿的含量[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2008(6): 519-522.

[3]王朝虹,果德安,胡春華.反相高效液相色譜法測定全尿中馬錢子堿和士的寧的含量[J].色譜,2003(4):382-384.

收稿日期：2014-09-15責(zé)任編校：李烽

【基金項目】重慶市高校優(yōu)秀成果轉(zhuǎn)化項目“藥物毒物分析中提取關(guān)鍵技術(shù)的成果轉(zhuǎn)化”資助。

【文章編號】1673―2391(2015)01―0144―02

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】D631