基于相似度價(jià)比法優(yōu)化天然藥物有效成分的提取工藝

嚴(yán) 婧 ，李亞梅 ，賀福元 ，譚 茜 ，章 瑩 ，黃 杰 ，謝雪姣 ，廖端芳 ，吳 萍

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) a. 干細(xì)胞中藥調(diào)控與應(yīng)用研究室；b. 湖南省中藥不良成分快速檢測(cè)及脫除工程技術(shù)研究中心/中藥有毒物質(zhì)防控技術(shù)湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南省教育廳 中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

基于相似度價(jià)比法優(yōu)化天然藥物有效成分的提取工藝

嚴(yán) 婧1a，b，李亞梅1b，賀福元2，譚 茜1a，章 瑩1a，黃 杰1a，謝雪姣1a，廖端芳1a，b，吳 萍1a，b

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) a. 干細(xì)胞中藥調(diào)控與應(yīng)用研究室；b. 湖南省中藥不良成分快速檢測(cè)及脫除工程技術(shù)研究中心/中藥有毒物質(zhì)防控技術(shù)湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南省教育廳 中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

為了給天然藥物有效成分最佳提取工藝條件的評(píng)價(jià)與篩選提供參考，以鐵皮石斛多糖的提取工藝為例，在單因素、正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用一種新的提取工藝評(píng)價(jià)方法——相似度價(jià)比法，采用夾角余弦法計(jì)算其相似度價(jià)比，結(jié)合提取得率和生產(chǎn)成本，對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：應(yīng)用相似度價(jià)比法分析得到的鐵皮石斛多糖酶提的最佳工藝條件為：固液比為1︰30，纖維素酶濃度為1.2%，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為1 h。文中認(rèn)為，相似度價(jià)比法綜合考慮了提取得率和經(jīng)濟(jì)效率，是評(píng)價(jià)和優(yōu)選高效率低成本的天然藥物有效成分提取工藝的一種新方法。

提取工藝；相似度價(jià)比法；夾角余弦法；鐵皮石斛多糖

天然藥物提取工藝的篩選對(duì)于天然藥物有效成分的獲得及質(zhì)量保證具有十分重要的影響。目前，主要以成分含量或藥效作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]，通過(guò)正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出最佳提取工藝條件[2-3]；但這種工藝篩選與評(píng)價(jià)方法是不計(jì)工藝成本的。因此，基于工藝成本角度考慮，筆者應(yīng)用了一種新的工藝評(píng)價(jià)方法——相似度價(jià)比法來(lái)優(yōu)化傳統(tǒng)中藥鐵皮石斛有效成分的提取工藝。

鐵皮石斛Dendrobium of ficinaleKimura et Migo為多年生草本植物，能益胃生津、滋陰清熱、調(diào)節(jié)免疫力[4-6]，與人參、冬蟲夏草等并稱為“中華九大仙草”。有關(guān)研究結(jié)果表明，鐵皮石斛中主要的生物活性物質(zhì)是多糖類化合物[7-8]。本研究以石斛多糖的提取工藝為模型，在單因素與正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的基礎(chǔ)上，引入相似度價(jià)比法，結(jié)合提取率和生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益來(lái)優(yōu)化提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試品鐵皮石斛由湖南龍石山鐵皮石斛基地有限公司提供，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶教授鑒定，打粉后過(guò)140目篩；苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇均為分析純；無(wú)水葡萄糖由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（批號(hào)為0833-9501）；纖維素酶，Solarbio公司，批號(hào)為507A0214。

恒溫?cái)?shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 夾角余弦相似度的計(jì)算

設(shè)提取工藝1、2的特征點(diǎn)集表示為X(x1，…，xi，…，xn)、Y(y1，…，y2，…，yn)，（n=1，…，n），其中X、Y表示工藝影響因素的特征值，n表示影響因素的個(gè)數(shù)。則夾角余弦法公式[9]表示2個(gè)提取工藝的相似度如下：

式（1）中：Sxy表示兩個(gè)提取工藝間的相似度，該數(shù)值保持在 0～1的范圍內(nèi)?？紤]到提取工藝影響因素的特征值的大小對(duì)整個(gè)余弦值的貢獻(xiàn)程度不同，因此把影響因素的每個(gè)特征值都轉(zhuǎn)化為占因素總水平之和的百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算其相似度 ，即為式（2）或式（3）：

將公式（2）或（3）代入公式（1）中計(jì)算得到的余弦值能更好地體現(xiàn)兩個(gè)提取工藝的相似度，Sxy值越接近1，說(shuō)明兩者相似度越大。

1.2.2 相似度價(jià)比的計(jì)算

在經(jīng)濟(jì)學(xué)上，常用性價(jià)比即性能與價(jià)格的比值來(lái)評(píng)價(jià)一個(gè)商品，提高性價(jià)比不僅要求產(chǎn)品的質(zhì)量高，而且要求生產(chǎn)產(chǎn)品的成本低。筆者參照經(jīng)濟(jì)學(xué)上的性價(jià)比概念，以提取率與相似度的比值作為相似度價(jià)比（α）[10]，以此來(lái)評(píng)價(jià)天然藥物提取的綜合效益，以η表示提取率，相似度價(jià)比的計(jì)算公式見式（4）。

在相同提取效率下宜選擇更低成本的提取工藝，即相似度價(jià)比值越大，該提取工藝的提取率和經(jīng)濟(jì)效益的綜合效益越大。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用苯酚-硫酸法制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：即以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，精密配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品加入5%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，充分搖勻，于100 ℃下水浴20 min后立即冰浴5 min，然后于488 nm處測(cè)定其吸光度；再以吸光度A為縱坐標(biāo)，多糖濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得如下線性回歸方程。

A=0.016C－0.026，R2=0.999。

1.2.4 優(yōu)化鐵皮石斛多糖酶提條件的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

精密稱取鐵皮石斛超微粉2.0 g，在固定其他因素的情況下，考察了固液比、酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)鐵皮石斛多糖的溶出量的影響情況。

1.2.5 優(yōu)化鐵皮石斛多糖酶提條件的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，考察固液比（A）、酶濃度（B）、酶解溫度（C）和時(shí)間（D）四因素對(duì)鐵皮石斛多糖的影響情況，正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表l。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 The orthogonal test factor levels

1.2.6 夾角余弦相似度法優(yōu)選提取工藝

先按公式（2）或（3）把因素A、B、C、D的 4個(gè)實(shí)驗(yàn)水平的測(cè)定值分別轉(zhuǎn)化為占該因素總水平之和的百分?jǐn)?shù)，再按夾角余弦法即公式（1）計(jì)算其相似度，最后按公式（4）計(jì)算相似度價(jià)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同固液比、酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)鐵皮石斛多糖溶出量的影響情況如圖1所示。由圖可知，溶劑體積的增大、纖維素酶濃度的增多、酶解溫度的上升、酶解時(shí)間的延長(zhǎng)都會(huì)增加鐵皮石斛多糖的溶出量，當(dāng)固液比為1∶30、酶濃度為1.2%、溫度為60 ℃、酶解時(shí)間為1 h時(shí)，鐵皮石斛多糖溶出量曲線不再上升而進(jìn)入到一個(gè)平緩期，因此可認(rèn)為在此條件下的多糖溶出量有最大值。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of single factor test

固液比(A)、酶濃度(B)、酶解溫度(C)和酶解時(shí)間(D)四個(gè)因素的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析（見表2）可知，各因素的主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即最重要的因素為固液比，其次是酶的用量、酶解時(shí)間，最后是酶解溫度。酶提法的最佳工藝組合為A2B2C3D1：固液比1∶30，纖維素酶1.2%，在60 ℃的溫度條件下水浴提取1 h。方差分析結(jié)果（見表3）表明，因素A、B、C、D的P值均小于0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為，這四個(gè)因素都是主要因素，對(duì)實(shí)驗(yàn)都有重要影響。在最佳工藝條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得多糖含量為21.9%，RSD為2.14%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表2 多糖酶提工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n＝3）Table 2 Orthogonal test analysis of enzymes process of polysaccharides

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.3 以?shī)A角余弦相似度法優(yōu)選提取工藝

根據(jù)夾角余弦法計(jì)算相似度和相似度價(jià)比值，結(jié)果見表4。從相似度價(jià)比值看，5號(hào)實(shí)驗(yàn)組的相似度價(jià)比值最大，說(shuō)明該提取條件的成本最低，這與正交實(shí)驗(yàn)的最佳結(jié)果恰好一致。因此，無(wú)論從提取率或提取工藝成本考慮，第5組的實(shí)驗(yàn)條件不僅是提取效率最高也是最有經(jīng)濟(jì)效率的提取條件，即在固液比1∶30的情況下用1.2%的纖維素酶在60 ℃的溫度條件下水浴提取1 h。

表4 相似度及相似度價(jià)比值的計(jì)算結(jié)果Table 4 The calculation results of similarity and similarity bid ratio

3 結(jié)論與討論

目前獲得天然藥物有效成分的方法多種多樣，提取條件不一，怎樣科學(xué)評(píng)價(jià)其提取工藝，這對(duì)天然藥物制劑工業(yè)化生產(chǎn)有著重要意義。本研究以鐵皮石斛多糖酶提工藝為模型，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，先通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選多糖提取工藝，再引入相似度、相似度價(jià)比值的概念，采用夾角余弦法[9-12]分析了提取工藝中各影響因素的相似度，將天然藥物有效成分提取工藝的提取率與工藝成本的比值定義為該提取工藝的相似度價(jià)比值，可在天然藥物提取工藝穩(wěn)定性的控制過(guò)程中從整體上綜合評(píng)價(jià)該提取工藝的差異程度。本實(shí)驗(yàn)以相似度價(jià)比法與正交實(shí)驗(yàn)法研究得到的最優(yōu)工藝條件相同，即在固液比為1∶30的情況下用1.2%的纖維素酶在60 ℃的溫度條件下水浴提取1 h。運(yùn)用相似度價(jià)比法選擇提取工藝，不僅考慮了提高天然藥物有效成分提取率和純度的工藝條件要求，更綜合考慮了工業(yè)生產(chǎn)中降低提取成本、提高經(jīng)濟(jì)效益與優(yōu)化天然藥物提取工藝的重要關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室最優(yōu)工藝和工業(yè)化生產(chǎn)最優(yōu)工藝的同步化，這對(duì)天然藥物制劑的實(shí)際生產(chǎn)具有參考價(jià)值。

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Optimization of extraction technology for natural medicine effective component by similarity bid method

YAN Jing1a,b, LI Ya-mei1b, HE Fu-yuan2, TAN Xi1a, ZHANG Ying1a, HUANG Jie1a, XIE Xue-jiao1a, LIAO Duan-fang1a,b, WU Ping1a,b
(1a. Hunan University of Chinese Medicine Stem Cell Laboratory of Regulation and Application；1b. Hunan Research Center of Engineering Technology for Rapid Test and Removal of Toxic and Harmful Substances in Chinese Medicine /Hunan Engineering Laboratory for Prevention and Control Technology of Toxic Substances in Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan, China; 2. Key Laboratory of Modernization of Chinese Medicine Hunan Provincial Department of Education, Changsha 410208, Hunan, China)

To provide reference for extraction technological conditions of natural medicine effective components, Dendrobium of ficinale polysaccharide extraction process, for example, on the basis of single factor and orthogonal test, the price included angle cosine method to calculate similarity ratio, combined with the extraction yield and production and economic bene fits to optimize extraction process. Results show that by the method of orthogonal test, in the case of enzymes extraction technology for Dendrobium of ficinale polysaccharides, the optimum process in laboratory was as follows: solid-liquid ratio 1:30, cellulose enzyme dosage 1.2%, extracting temperature 60℃ and extracting time 1 h; The optimum process of industrialization was in conformity with the optimum condition for laboratory. This paper argues that the similarity price ratio method considering the access ef ficiency and economic ef ficiency, is a kind of evaluation and optimization of high ef ficiency low cost new methods of natural medicine effective component extraction process.

extraction technology; the method of similar price quality; the cosine method

S759.8

A

1673-923X(2016)10-0124-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.10.022

2016-04-12

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（14A109）；湖南省科技廳發(fā)改委項(xiàng)目（ [2013]1199）；企業(yè)橫向合作項(xiàng)目（合同編號(hào)：2014）；湖南省科技廳科研條件創(chuàng)新專項(xiàng)（2012TT2012）；湖南省教學(xué)改革研究項(xiàng)目（2012-202）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年教師基金（99820001134）；湖南省研究生省級(jí)科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2015B336）；湖南省研究生校級(jí)科研創(chuàng)新項(xiàng)目（2015 CX19）

嚴(yán) 婧，碩士研究生

吳 萍，副教授，碩士研究生導(dǎo)師；E-mail：545371528@qq.com

嚴(yán) 婧，李亞梅，賀福元，等. 基于相似度價(jià)比法優(yōu)化天然藥物有效成分的提取工藝[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,36(10): 124-127.

[本文編校：吳 彬]