·論著·

血小板特異性抗體聯(lián)合檢測(cè)在免疫性血小板減少癥鑒別診斷中的價(jià)值*

李芳，樸文花△，李芹，白潔，杜宗孝

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷中心，寧夏銀川 750002)

摘要:目的通過檢測(cè)血小板減少癥患者外周血B淋巴細(xì)胞血小板膜糖蛋白特異性抗體的變化，探討其表達(dá)水平變化對(duì)血小板減少癥鑒別診斷的臨床意義。方法應(yīng)用流式微球技術(shù)檢測(cè)血小板減少癥患者及健康對(duì)照者外周血GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX的表達(dá)水平。結(jié)果原發(fā)ITP與繼發(fā)ITP患者血小板特異性抗體GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血小板特異性抗體GPⅠb/ⅠX診斷原發(fā)ITP的敏感度43%，特異度89%；GPⅡb/Ⅲa診斷原發(fā)ITP的敏感度86%，特異度83%。兩者聯(lián)合診斷敏感度90%，特異度83%。結(jié)論聯(lián)合檢測(cè)兩種血小板抗體，提高原發(fā)ITP和SLE的診斷陽性率；GPⅠb/ⅠX在ITP中的診斷優(yōu)勢(shì)不如GPⅡb/Ⅲa。

關(guān)鍵詞:免疫性血小板減少癥；血小板特異性抗體；流式微球技術(shù)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)，既往稱“特發(fā)性血小板減少性紫癜”，是一組最為常見的以皮膚黏膜出血為主要特征的血小板減少性疾病，在臨床上屬于一種自身免疫性綜合征。兒童發(fā)病率為1.9～6.4/10萬；成年人發(fā)病率5～10/10萬。臨床上為一種綜合患者病史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查的排外性診斷。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)血小板特異性抗體的檢測(cè)主要方法有ELISA及血小板抗原單克隆抗體固相化檢測(cè)(MAIPA)[1]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式微球技術(shù)(CBA)，聯(lián)合檢測(cè)原發(fā)和繼發(fā)ITP患者血小板膜表面糖蛋白特異性抗體GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX，提高ITP診斷的敏感度和特異度，為ITP的早期診斷、鑒別診斷及療效評(píng)價(jià)提供可靠的實(shí)驗(yàn)室資料。

1資料與方法

1.1一般資料篩選2010年1月至2013年2月在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院血液科住院治療的原發(fā)ITP114例，其中男性46例，女性68例，中位年齡(49.6±17.1)歲，原發(fā)性ITP患者診斷均符合國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)[2]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)25例，其中男性3例，女性22例，中位年齡(43.6±14.6)歲；肝硬化44例，男性26例，女性18例，中位年齡(63.3±9.1)歲；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)39例，男性16例，女性23例，中位年齡(37.6±10.6)歲。對(duì)照組為血小板減少的急、慢性白血病共32例，其中男性16例，女性16例，中位年齡58歲，平均(44.1±12.2)歲；急、慢性白血病診斷均符合國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)[2]。病例組包括原發(fā)ITP、SLE、RA和肝硬化。

1.2儀器與試劑FACS AriaII Cell Sorter流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；CD41(GPⅡb/Ⅲa)單抗、CD42(GPⅠb/ⅠX)單抗、羊抗鼠抗體均為BD醫(yī)療器械(上海)有限責(zé)任公司提供；親和純化的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG(Fc)及蛋白酶抑制劑Sigma公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1樣品處理采集EDTA抗凝的外周靜脈血，混勻后800 r/min離心10 min，吸取上層血漿至EP管中，2 500 r/min離心10 min,吸取血小板裂解液各50 μL至4個(gè)EP管中，然后分別加入用4種單抗包被的微球各50 μL(反應(yīng)體積100 μL)，室溫振蕩孵育2 h，洗滌液洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗人IgG抗體。室溫震蕩30 min，洗滌后加500 μL 0.01 mol/L PBS緩沖液重懸微球。

1.3.2樣品檢測(cè)于第1、2、5、10、20、30、40天應(yīng)用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG多克隆抗體檢測(cè)包被聚苯乙烯微球的熒光強(qiáng)度，以測(cè)試包被微球穩(wěn)定性。FSC/SSC散點(diǎn)圖圈出檢測(cè)微球門，獲取2 000～3 000個(gè)微球，記錄FL-2直方圖中檢測(cè)微球的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。檢測(cè)樣本的同時(shí)，將3個(gè)健康人的血樣作為對(duì)照組，計(jì)算對(duì)照組MFI的均值，將樣本的MFI與之比較并計(jì)算比率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，多個(gè)樣本的兩兩比較采用秩和檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血小板抗體GPⅠb/Ⅸ與GPⅡb/Ⅲa在病例組與對(duì)照組熒光強(qiáng)度表達(dá)病例組與對(duì)照組血漿中血小板特異性抗體GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

項(xiàng)目原發(fā)ITPSLE肝硬化RA對(duì)照組GPⅡb/Ⅲa5.4±4.76.0±6.410.0±5.86.3±8.30.3±0.4GPⅠb/ⅠX3.0±3.310.5±25.64.8±5.23.4±6.20.4±0.4

2.2血小板抗體GPⅡb/Ⅲa與 GPⅠb/ⅠX在免疫相關(guān)血小板減少癥中的陽性率測(cè)定所有患者血清中GPⅡb/Ⅲa 與GPⅠb/ⅠX抗體，見表2，GPⅠb/ⅠX抗體總陽性率較GPⅡb/Ⅲa抗體低(P<0.05)。在16例GPⅡb/Ⅲa抗體陰性的原發(fā)ITP中有5例GPⅠb/ⅠX抗體陽性；5例GPⅡb/Ⅲa抗體陰性的SLE中有3例GPⅠb/ⅠX抗體陽性。將兩種抗體聯(lián)合檢測(cè)，原發(fā)ITP和SLE的診斷陽性率明顯提高。

表2兩種血小板抗體GPⅡb/Ⅲa與 GPⅠb/ⅠX在血小板減少癥中的陽性率(%)

項(xiàng)目原發(fā)ITPSLE肝硬化RA對(duì)照組GPⅡb/Ⅲa867697620GPⅠb/ⅠX434050385GPⅡb/Ⅲa與GPⅠb/ⅠX382850380GPⅡb/Ⅲa或GPⅠb/ⅠX908897625

2.3血小板抗體聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)ITP的診斷價(jià)值GPⅡb/Ⅲa與GPⅠb/ⅠX血小板抗體檢測(cè)原發(fā)ITP的敏感度、特異度，陽性預(yù)測(cè)值，見表3。聯(lián)合兩種血小板抗體檢測(cè)原發(fā)ITP的敏感度、陰性預(yù)測(cè)值提高、特異度及陽性預(yù)測(cè)值基本未變。

表3兩種血小板抗體診斷原發(fā)ITP敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值(%)

項(xiàng)目敏感度特異度陽性預(yù)測(cè)值陰性預(yù)測(cè)值GPⅡb/Ⅲa86839850GPⅠb/ⅠX53898620GPⅡb/Ⅲa與GPⅠb/ⅠX90839760

3討論

血小板減少癥是臨床上最為常見的出血性疾病、是臨床常見的癥狀。引起血小板減少的原因較多，從病因?qū)W上主要分為累及“細(xì)胞” 和“抗體”所導(dǎo)致的血小板生成減少(障礙)和外周血小板破壞增多?！翱寡“遄陨砜贵w”導(dǎo)致的“血小板破壞增多”是ITP的主要病因[3-4]，其次是抗復(fù)合體GPⅠb/ⅠX以及其他血小板糖蛋白。2007年，國(guó)際ITP工作組將既往命名的“特發(fā)性血小板減少性紫癜”更名為“免疫性血小板減少癥”，英文縮寫不變，按病因分為“原發(fā)ITP”和“繼發(fā)ITP”[5]。2009年國(guó)內(nèi)中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液分會(huì)在《中華血液學(xué)雜志》上發(fā)表“成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國(guó)專家共識(shí)(第1版)”[2]，正式將本病更名為“原發(fā)免疫性血小板減少癥”。血小板減少可見于SLE、肝硬化等自身免疫性疾病。血小板破壞增多，既可由免疫性因素引起，也可由非免疫性因素(聚集消耗)引起。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)血小板減少癥患者外周血血漿中的血小板特異性抗體。流式微球技術(shù)是基于流式細(xì)胞術(shù)而發(fā)展的新技術(shù)，以聚苯乙烯微球?yàn)榉磻?yīng)界面，利用特異性抗體包被后即可俘獲一些小分子物質(zhì)，再通過放大作用進(jìn)行檢測(cè)[6-7]。

本研究表明，GPⅠb/ⅠX抗體在原發(fā)ITP及繼發(fā)ITP中均可檢測(cè)到，ITP患者大部分血小板特異性自身抗體的靶抗原是GPⅡb/Ⅲa，血小板抗體GPⅠb/ⅠX在ITP診斷中敏感度較GPⅡb/Ⅲa低。分析血小板抗體GPⅠb/ⅠX檢出率低可能原因是在多數(shù)ITP患者中，均是血小板抗體GPⅠb/ⅠX和GPⅡb/Ⅲa兩種抗體聯(lián)合存在的，只有很少部分患者是單獨(dú)存在GPⅠb/ⅠX抗體。聯(lián)合這兩種血小板抗體提高了ITP診斷敏感度及特異度。一部分SLE患者GPⅡb/Ⅲa陰性，聯(lián)合這兩種血小板抗體對(duì)于SLE的診斷有價(jià)值。

綜上所述，血小板特異性抗體檢測(cè)具有較高的特異度，將兩種抗體聯(lián)合檢測(cè)，原發(fā)ITP和SLE的診斷陽性率明顯提高，同時(shí)在血小板減少癥(ITP和非ITP)的鑒別診斷中具有一定價(jià)值[8-9]。

參考文獻(xiàn)

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The differential diagnosis value of detection of platelet specific autoantibody on idiopathic thrombocytopenic*

LiFang,PiaoWenhua△,LiQin，BaiJie，DuZongxiao

(ClinicalMedicalTestDiagnosisCenter,NingxiaPeople′sHospital,Yinchuan,Ningxia750002,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the changes and clinical significance of the expression of anti-GPⅡb/Ⅲa and anti-GPⅠb/ⅠX on anti-secreting B cells in patient with thrombocytopenia.MethodsExpression of anti-GPⅡb/Ⅲa and anti-GPⅠb/ⅠX specific autoantibodies in thrombocytopenia were tested with(CBA).ResultsThere were significantly more circulating anti-GPⅠb/ⅠX and anti-GPⅡb/Ⅲa antibody-producing B cells in primary ITP(P<0.05) for all comparisons.For diagnosing primary ITP，the anti-GPⅠb/ⅠX had 43% sensitivity and 89% specificity,whereas the anti-GPⅡb/Ⅲa had 86% sensitivity and 83% specificity.When two tests were combined,the sensitivity improved to 90% without a reduction in specificity.ConclusionThe assay for detecting anti-GPⅠb/ⅠX is useful for identifying patients with ITP,but its utility for diagnosing ITP is inferior to the anti-GPⅡb/Ⅲa assay.

Key words:immune thrombocytopenia；platelet specific autoantibody;cytometric bead assay

(收稿日期：2015-05-05)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.15.004

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)15-2135-02

*基金項(xiàng)目：寧夏自然科學(xué)基金自助項(xiàng)目(NZ11167)。

作者簡(jiǎn)介：李芳，女，副主任醫(yī)師，主要從事血液病細(xì)胞形態(tài)學(xué)、病理學(xué)及流式細(xì)胞學(xué)診斷研究。△通訊作者，E-mail：wenhuapiao@163.com。