·論著·

隱球菌性腦膜炎患者中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的高表達(dá)及其臨床意義*

黃元蘭1，康敏榮1，胡志德2，閆偉1，鄧安梅3△

(1.解放軍第四五五醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200052；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，山東濟(jì)南 250031；

3.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200433)

摘要:目的研究Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22在隱球菌性腦膜炎患者發(fā)病機(jī)制中的作用。方法收集了2011年2月至2013年2月期間來院就診的免疫功能正常的隱球菌患者22例以及同期來院體檢的健康個(gè)體20例，收集外周抗凝血，分離了外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用RT-PCR以及ELISA檢測(cè)了隱球菌性腦膜炎患者和健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Th17相關(guān)細(xì)胞因子1L-17A、IL-17F以及IL-22的mRNA表達(dá)以及血漿中各蛋白水平的表達(dá)。并分析其與腦脊液蛋白濃度、顱內(nèi)壓、腦脊液隱球菌抗原滴度、腦脊液葡萄糖濃度的關(guān)系。結(jié)果隱球菌性腦膜炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-17A、IL-22的mRNA水平以及血漿中IL-17A、IL-22水平較健康對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，且與隱球菌性腦膜炎患者的預(yù)后因子腦脊液蛋白濃度、顱內(nèi)壓、腦脊液隱球菌抗原滴度、腦脊液葡萄糖濃度相關(guān)。結(jié)論Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-22可能參與了隱球菌性腦膜炎的發(fā)病機(jī)制，可能是潛在的評(píng)價(jià)隱球菌性腦膜炎病情的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞:隱球菌性腦膜炎；Th17；細(xì)胞因子

隱球菌性腦膜炎(以下簡(jiǎn)稱隱腦)是一種嚴(yán)重危害人類健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染性疾病，其起病隱匿，病程較長(zhǎng)，致死、致殘率較高[1]。其發(fā)病的顯著特點(diǎn)是發(fā)生于免疫力低下的人群，如HIV感染者和器官移植患者，提示正常的免疫功能對(duì)于抵御隱球菌感染具有十分重要的作用。CD4+的Th細(xì)胞是一群與隱球菌感染免疫反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞，在隱腦小鼠模型中開展的研究表明，去除CD4+的Th細(xì)胞或者中和干擾素-γ將加速隱腦病情的發(fā)展，提示CD4+的Th細(xì)胞對(duì)隱腦具有保護(hù)作用[2]。此外，研究還表明，CD8+的T細(xì)胞可以通過顆粒溶素發(fā)揮抗隱球菌作用，但該作用的發(fā)揮依賴于CD4+的Th細(xì)胞的存在[3]。由此可見，CD4+的Th細(xì)胞是機(jī)體清除隱球菌感染的必要手段[4]。目前比較公認(rèn)的Th細(xì)胞亞群包括Th1、Th2、Treg和新近發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞[5]。Th17細(xì)胞以分泌白細(xì)胞介素(IL)-17A、IL-17F和IL-22為顯著特征，在多種自身免疫性疾病和感染性疾病中發(fā)揮重要作用[6]。到目前為止，Th17細(xì)胞在隱球菌感染與免疫中發(fā)揮的作用還不是很明確[7]。但尚缺乏在臨床水平證實(shí)Th17細(xì)胞參與隱球菌感染免疫反應(yīng)的證據(jù)。本研究旨在通過ELISA檢測(cè)隱球菌性腦膜炎患者外周血IL-17A、IL-17F和IL-22的表達(dá)，初步分析Th17細(xì)胞在隱球菌性腦膜炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料22例隱腦患者來自長(zhǎng)海醫(yī)院2008年2月至2010年2月期間長(zhǎng)海醫(yī)院收治的患者，并排除自身免疫性疾病、HIV感染者和器官移植患者。所有患者均為首診患者，未接受過抗真菌治療。其中男女之比為14∶8，平均年齡(40.7±18.5)歲。隱腦的診斷標(biāo)準(zhǔn)為為腦脊液真菌涂片、培養(yǎng)和隱球菌乳膠凝集試驗(yàn)結(jié)果中的任一個(gè)陽性[8]。從解放軍第四五五醫(yī)院健康查體的患者中挑選20例健康個(gè)體作為健康對(duì)照組，并按照年齡相近、性別相同的原則與隱腦組進(jìn)行1∶1配對(duì)研究。健康對(duì)照個(gè)體健康查體個(gè)體實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)常規(guī)檢查未見明顯異常。

1.2儀器與試劑KUBOTA-5420臺(tái)式高速離心機(jī)(日本Kubota公司)；721型紫外分光光度儀(美國(guó)Backman公司)；ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(美國(guó)Applied iosystems公司；高速冷凍離心機(jī)centrifuge，5417R(EPPENDORF，germany)；低溫冰箱MDF-292(SANYO)；淋巴細(xì)胞分離液LymphoprepTM(挪威AXIS-SHIELD公司)；TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Applied iosystems公司)，ELISA試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司)；RNA抽提試劑盒為Rneasy Mini Kits(德國(guó)Qiagen公司)；引物(由上海生工有限公司)；DEPC(博彩生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的采集對(duì)上述22例隱腦患者和20例健康對(duì)照者分別采清晨空腹靜脈血5 mL，以1∶9枸櫞酸鈉抗凝，離心后取上清，置EP管中-20 ℃保存，同批檢測(cè)；另剩全血用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。

1.3.2細(xì)胞總RNA的抽提以RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kits(Qiagen)抽提PBMCs中的總RNA，以每管10 μL分裝抽提的總RNA，凍存于-80 ℃冰箱中；紫外分光光度儀檢測(cè)A260和A280，計(jì)算RNA的濃度。

1.3.3引物和探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)基因庫(kù)中人IL-17F、IL-17A、IL-22和選作內(nèi)參的人GAPDH的mRNA序列，所有引物和探針均訂購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3.4RNA的逆轉(zhuǎn)錄采用美國(guó)Applied Biosystems公司的TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以隨機(jī)引物，分別將從SS患者，健康體檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞中抽提的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA分裝，凍存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.5熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IL-17A、IL-17F以及IL-22的mRNA水平表達(dá)以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用美國(guó)Applied Biosystems公司的PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，PCR擴(kuò)增條件為93 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 55 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)IL-17A、IL-17F以及IL-22mRNA的表達(dá)水平。PCR檢測(cè)結(jié)果以2-ΔΔCt表示設(shè)定健康對(duì)常組的相對(duì)表達(dá)量為1。

1.3.6ELISA檢測(cè)血漿中Th17細(xì)胞因子的水平以及腦脊液分析將收集的血漿復(fù)溶，采用ELISA法檢測(cè)外周血IL-17A、IL-17F和IL-22濃度。檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscicence公司，按照試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。腦脊液的采集在患者入院2 d內(nèi)完成，并進(jìn)行腦脊液蛋白和葡萄糖濃度分析，腦脊液內(nèi)隱球菌抗原滴度的檢測(cè)采用美國(guó)immuno-Mycologics有限公司生產(chǎn)的隱球菌抗原乳膠檢測(cè)系統(tǒng)。

2結(jié)果

2.1患者和健康對(duì)照組PBMC中Th17細(xì)胞效應(yīng)因子的mRNA水平隱球菌性腦膜炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-17A、IL-22mRNA水平較健康對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，而兩組中IL-17F的水平則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1(見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.2兩組外周血Th17細(xì)胞效應(yīng)因子濃度比較隱球菌患者血漿IL-17A、IL-17F和IL-22水平較健康對(duì)照組顯著增高，見圖2(見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)，其中以IL-17A、IL-22在兩組差異最大，隱腦組患者外周血IL-17A、IL-22水平約為健康對(duì)照組2倍。

2.3患者血漿IL-17A、IL-17F、IL-22與腦脊液特征的關(guān)系為進(jìn)一步研究Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在隱球菌性腦膜炎發(fā)病機(jī)制中的作用，分析了IL-17A、IL-17F、IL-22與上述腦膜炎預(yù)后因子之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦脊液蛋白濃度較高(≥1 mg/mL的隱球菌患者，外周血IL-17A、IL-22水平也較高(P值分別為0.009和0.036)；腦脊液葡萄糖濃度較低(<2 mol/L)的隱球菌患者，外周血IL-17A和IL-17F水平也較高(P值分別為0.013和0.047)；腦脊液隱球菌抗原滴度較高者(≥1 024)的隱球菌患者，外周血IL-22水平明顯增高(P=0.000)；顱內(nèi)壓增高(≥250 mm Hg)的隱球菌患者，外周血IL-17A和IL-22水平也顯著增高(P值分別為0.013和0.028)。見表1。

表1比較不同隱腦患者外周血相關(guān)細(xì)胞因子水平(pg/mL)

項(xiàng)目nIL-17AIL-17FIL-22腦脊液蛋白 <1mg/mL1035.30±10.4197.70±40.93114.10±45.46 ≥1mg/mL1254.75±18.49144.25±60.08152.92±41.93 P0.0090.0690.036腦脊液葡萄糖 <2mol/L1155.00±18.95145.82±60.94146.54±48.93 ≥2mol/L1136.82±11.79100.36±42.55124.00±44.06 P0.0130.0470.217腦脊液隱球菌抗原滴度 <10241341.00±17.49108.31±45.03108.77±40.34 ≥1024953.00±17.19144.44±66.46173.56±23.19 P0.0960.2090.000顱內(nèi)壓 <250mmHg1136.00±10.21107.00±50.46111.91±49.04 ≥250mmHg1155.82±18.97139.18±59.54158.64±31.77 P0.0130.3320.028

3討論

天然免疫和獲得性免疫是機(jī)體清除真菌如新型隱球菌感染的主要手段，一方面可以通過炎癥因子非特異性清除隱球菌，另一方面則通過合成相應(yīng)的細(xì)胞因子促進(jìn)Th細(xì)胞的分化。Th細(xì)胞可分為Th1、Th2、Treg以及Th17細(xì)胞，傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為Th17細(xì)胞可以分泌IL-17A、IL-17F和IL-22，雖然都是Th17細(xì)胞的效應(yīng)因子，但其生物學(xué)功能不盡相同，其中IL-17A和IL-17F的主要作用在于募集中性粒細(xì)胞至感染部位，促進(jìn)病原體的消滅[9]。IL-22則是參與黏膜反應(yīng)的重要的細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞合成各種抗菌肽，促進(jìn)病原體的消滅[10]。隱腦患者上述三個(gè)細(xì)胞因子在外周血的濃度較健康個(gè)體顯著增高，提示在隱球菌感染的過程中，可能伴隨Th17細(xì)胞功能的亢進(jìn)，其通過分泌IL-17A、IL-17F和IL-22而促進(jìn)隱球菌的清除。由此可見，在人體內(nèi)，Th17細(xì)胞可能是參與隱球菌感染與免疫的積極因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，隱球菌性腦膜炎患者血漿IL-17A和IL-22水平較健康對(duì)照組顯著增高，提示其參與了隱球菌性腦膜炎的發(fā)病機(jī)制。而兩組IL-17F的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同時(shí)，IL-17A和IL-22與隱腦已知的預(yù)后因子顱內(nèi)壓、腦脊液隱球菌抗原滴度、腦脊液葡萄糖以及蛋白濃度相關(guān)，表明其還可能是隱腦潛在的病情分級(jí)指標(biāo)。

以往的研究表明，隱腦患者就診時(shí)顱內(nèi)壓增高、腦脊液中隱球菌抗原滴度增高、腦脊液葡萄糖濃度降低、腦脊液蛋白濃度增高預(yù)示腦膜炎患者預(yù)后較差[11-12]。因此上述指標(biāo)在一定程度上可以作為疾病嚴(yán)重程度劃分的依據(jù)。此外，最新的研究指出，IL-17A在新型隱球菌感染后機(jī)體的免疫反應(yīng)中起著重要的作用，它可能通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞的聚集、活化以及干擾素的分泌來參與機(jī)體的防御反應(yīng)[13-14]。而有研究指出IL-22主要由CD4+Th17細(xì)胞分泌而表達(dá)于各種活化的T細(xì)胞亞型、NK細(xì)胞以及DC細(xì)胞[15]，且在隱球菌感染的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)IL-22對(duì)機(jī)體的抗隱球菌免疫反應(yīng)起著重要的作用[16]?；谏鲜鲅芯浚謩e按照顱內(nèi)壓、腦脊液隱球菌抗原滴度、腦脊液葡萄糖以及蛋白濃度對(duì)隱腦患者進(jìn)行了分組，并比較各組血漿IL-17A、IL-17F和IL-22濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞因子特別IL-17A和IL-22在不同的組別間都或多或少存在差異。說明隱腦患者外周血IL-17A和IL-22水平與隱腦病情密切相關(guān)，可能是潛在的病情分級(jí)指標(biāo)甚至是疾病預(yù)后因子。當(dāng)然，該結(jié)論還需要大樣本、前瞻性的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步予以證實(shí)。

綜上所述，本研究在臨床水平證實(shí)了Th17細(xì)胞效應(yīng)因子尤其是IL-17A和IL-22參與了隱腦的發(fā)病機(jī)制，且患者血漿IL-17A和IL-22可能是潛在的病情分級(jí)指標(biāo)。

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The increased serum Th17 related cytokine concentration in patients with cryptococcal meningitis and its clinical significance*

HuangYuanlan1,KangMinrong1,HuZhide2,YanWei1,DengAnmei3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，No.455HospitalofPeople′sLiberationArmy,Shanghai200052,China;

2.DepartmentofClinicalLaboratory,GeneralHospitalofJi′nanMilitaryRegionofPeople′s

LiberationofArmy,Ji′nan,Shangdong250031,China；3.DepartmentofLaboratoryDiagnosis,

ChanghaiHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the IL-17A/F and IL-22,the Th17 related cytokine,in the serum of cryptococcal meningitis patients and its clinical implications.MethodsWe collected peripheral blood from 22 cryptococcal meningitis patients and 20 matched healthy controls from February 2011 to February 2013.Then the peripheral blood mononuclear cells(PBMC)were seperated with isodensity centrifugation.The RT-PCR and ELISA were used to detect the mRNA and protein lever of Th17 related cytokine such as IL-17A,IL-17F and IL-22.In addition,the relationship between these cytokines and cerebrospinal fluid characteristics were analyzed.ResultsThe serum concentration of IL-17A and IL-22 were much higher than that of healthy controls(P<0.01).Their concentration were even higher in patients with poor prognosis factors,including higher cerebrospinal fluid protein level and cryptococcal antigen titer,lower cerebrospinal fluid glucose concentration and increased cerebrospinal fluid open pressure.ConclusionIL-17A and IL-22 were involved in the pathogenesis of cryptococcal meningitis and may be a potential prognosis biomarker for cryptococcal meningitis.

Key words:cryptococcal meningitis;Th17;cytokine

(收稿日期：2015-04-08)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.15.006

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)15-2139-03

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273282)。

作者簡(jiǎn)介：黃元蘭，女，主管技師，主要從事感染與免疫以及自身免疫相關(guān)疾病研究。△通訊作者，E-mail:asdzsq2@163.com。