膽囊膽固醇結(jié)石的形成與肝臟核受體基因表達(dá)水平的相關(guān)性研究

高廣勇 馬云明 岑建農(nóng)

（1.蘇州工業(yè)園區(qū)婁葑醫(yī)院普外科 江蘇 蘇州 215000；2.江蘇省血液研究所 江蘇 蘇州 215000）

核受體（Nuclear Receptors）是編碼轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)超基因家族，在調(diào)節(jié)人體內(nèi)多種生理活動(dòng)中起到重要的作用。肝臟X受體(liver X receptor,LXR)和膽汁酸受體(Farnesoid X receptor,FXR)屬于核受體超基因家族[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，LXR和FXR在進(jìn)行膽汁酸-膽固醇代謝的過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了探討膽囊膽固醇結(jié)石的形成與肝臟核受體基因表達(dá)水平的相關(guān)性，我們對(duì)近年來(lái)我院收治的18例膽囊膽固醇結(jié)石患者和同時(shí)在我院接受肝臟血管瘤切除術(shù)且未患有膽結(jié)石的13 例患者的臨床資料進(jìn)行回顧性研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對(duì)象為近年來(lái)我院收治的18例膽囊膽固醇結(jié)石患者和同時(shí)在我院接受肝臟血管瘤切除術(shù)且未患有膽結(jié)石的13例患者。將18例膽囊膽固 醇結(jié)石患者作為實(shí)驗(yàn)組，將接受肝臟血管瘤切除術(shù)且未患有膽結(jié)石的13 例患者作為對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)組患者中，有男性患者6 例，女性患者12 例。他們的平均年齡為（39.44±5.61）歲。他們均接受了膽囊切除術(shù)，經(jīng)術(shù)后病理檢查均被確診患有膽固醇結(jié)石。在對(duì)照組患者中，有男性患者5 例，女性患者8 例。他們的平均年齡為（37.77±5.21）歲。他們均因患有肝臟血管瘤而接受了肝臟血管瘤切除術(shù)。他們經(jīng)術(shù)前影像學(xué)檢查及術(shù)中探查均被確診未患有膽結(jié)石。兩組患者在性別、年齡等一般資料方面相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 進(jìn)行總RNA提取和合成cDNA 在對(duì)兩組患者進(jìn)行相關(guān)的手術(shù)后，在其肝臟的邊緣切取其肝組織。切取肝組織的體積約為0.5 g。將切取下來(lái)的肝臟組織立即置于液氮中進(jìn)行凍存，再將其轉(zhuǎn)移至－70℃的冰箱中進(jìn)行保存以備用。使用TRIzol （由INVITROGEN公司生產(chǎn)）的試劑對(duì)患者切取下來(lái)的肝臟組織中的總RNA進(jìn)行提取。在使用DEPC-H2O 將總 RNA 稀釋到 0.5μg/μl后， 采用 M-MVL逆轉(zhuǎn)錄酶（由PROMEGA公司生產(chǎn)）試劑合成cDNA。

1.2.2 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)使用的引物是由Primer Express 軟件5.0（由美國(guó)Applied Biosystem公司生產(chǎn)）所設(shè)計(jì)的，并由上海生工公司進(jìn)行合成。PCR反應(yīng)體系包含：cDNA為200 ng， Eavgreen為1 μl，引物的濃度為200pM,在加入雙蒸水后使引物的體積達(dá)到25 μl。對(duì)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的PCR反應(yīng)。使用定量PCR儀（由MJ公司生產(chǎn)）對(duì)樣品進(jìn)行PCR 反應(yīng)。進(jìn)行PCR 反應(yīng)的條件是:當(dāng)溫度達(dá)到95℃5 min后對(duì)樣品進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，進(jìn)行PCR 反應(yīng)的閾值為0.05。進(jìn)行每1個(gè)循環(huán)的過(guò)程是：在溫度為95℃時(shí)進(jìn)行變性反應(yīng)20s。在溫度為58℃時(shí)退火20s。在溫度為72℃時(shí)進(jìn)行延伸操作20秒，在溫度為78℃時(shí)進(jìn)行讀板。在實(shí)時(shí)定量進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)結(jié)束后，使用熔解曲線對(duì)PCR 產(chǎn)物的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。 當(dāng)熔解曲線的溫度從60℃上至96℃的過(guò)程中，每上升0.2度進(jìn)行一次讀板。將PCR產(chǎn)物放置在瓊脂糖凝膠電泳中，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物條帶進(jìn)行觀察以檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物的特異性,并確定其不存在基因組DNA擴(kuò)增的現(xiàn)象。由PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得Ct值，然后計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)量。采用GDPAH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）作為內(nèi)參照。計(jì)算公式為：ΔC（t）=C（t）目的基因 -C(t)GDPAH， 基因表達(dá)的相對(duì)量 =2-ΔC（t）×10000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(由美國(guó)SPSS 公司生產(chǎn))對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)正負(fù)標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney），P＜0.05表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組患者的LXRα、FXR和SHP等基因mRNA的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組患者，二者相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者的 LXRβ基因及LRH-1基因 mRNA的表達(dá)水平相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。詳情見(jiàn)表1。

表 1兩組患者肝臟核受體基因mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

LXR和FXR可通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)以維持脂類代謝的平衡。ABCB11和ABCB4都是FXR的靶基因[2]。ABCG5和ABCG8都是LXR的靶基因。有研究證實(shí)，ABCB11、ABCB4 、ABCG5和ABCG8的表達(dá)水平與膽結(jié)石的形成密切相關(guān)[3，4]。ABCG5和ABCG8[5]都是位于肝細(xì)胞膽管側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在肝細(xì)胞分泌膽汁的過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)的研究結(jié)果顯示，初級(jí)膽汁酸鵝脫氧膽酸(CDCA)和膽酸(CA)均可與FXR的LBD相結(jié)合，從而可調(diào)控靶基因的表達(dá)[6]。FXR被稱為膽汁酸感受器，可維持膽汁酸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。FXR在膽汁酸代謝的過(guò)程中可通過(guò)3條途徑發(fā)揮作用:①通過(guò)I-BABP（回腸脂肪酸結(jié)合蛋白）調(diào)控小腸對(duì)膽汁酸的攝取量。②通過(guò)調(diào)控ABCB11（BSEP蛋白）和ABCB4的表達(dá)，以促進(jìn)膽汁酸和磷脂向膽道分泌。③通過(guò)調(diào)控CYP7A1的活性，以抑制膽固醇合成膽汁酸。CYP7A1是由膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸途徑中的限速酶。FXR需通過(guò)核受體SHP( short heterodimerpartner)和核受體LRH-1(liver receptor homolog-1) 對(duì)CYP7A1的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)[7]，從而調(diào)控膽汁酸的合成。

總之，膽囊膽固醇結(jié)石的形成與肝臟核受體基因mRNA的表達(dá)水平密切相關(guān)。因此，臨床上可將上述指標(biāo)作為膽囊膽固醇結(jié)石患者進(jìn)行診治的參考依據(jù)。

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