■王國強(qiáng) 王朋朋 劉超齊 常 娟 尹清強(qiáng) 王二柱 盧富山

（1.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南南陽473000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；

3

.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng)453000；4.河南省飼料微生物工程技術(shù)研究中心，河南周口466000）

隨著我國畜牧業(yè)與飼料工業(yè)迅猛發(fā)展，對(duì)飼料原料特別是蛋白質(zhì)原料的需求量急增，蛋白質(zhì)飼料原料的緊缺，已成為我國畜牧業(yè)發(fā)展的瓶頸。研究開發(fā)新的蛋白質(zhì)飼料資源，對(duì)我國畜牧業(yè)的發(fā)展將起到舉足輕重的作用。我國非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料資源豐富，但消化、吸收和利用率低，例如血粉、羽毛粉中蛋白質(zhì)消化利用率僅30%左右，棉籽粕(餅)和菜籽餅(粕)等蛋白質(zhì)飼料中含有毒素和抗?fàn)I養(yǎng)因子，嚴(yán)重地影響了其在畜禽飼料中大量使用。因此，如何提高非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料的營養(yǎng)價(jià)值及消化利用率，已成很多學(xué)者研究的課題。

許多研究證實(shí)，利用微生物發(fā)酵技術(shù)，能提高低品質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的營養(yǎng)價(jià)值，并消除其中的毒素和抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而緩解我國蛋白飼料資源的不足。同時(shí)，通過微生物發(fā)酵，可產(chǎn)生大量的酶類和其它生物活性物質(zhì)，大量的益生菌，有提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)及調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道微生物區(qū)系平衡的作用。微生物發(fā)酵包括細(xì)菌和真菌發(fā)酵兩種類型，真菌能分泌較多的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等，對(duì)提高非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料的營養(yǎng)價(jià)值效果顯著。本研究用本研究室保存的產(chǎn)蛋白酶活性較強(qiáng)的米曲霉為發(fā)酵菌種，用血粉、羽毛粉和棉粕為蛋白質(zhì)原料，采用固態(tài)發(fā)酵的方式制備代謝率高的復(fù)合蛋白質(zhì)飼料，利用肉雞的代謝試驗(yàn)測定發(fā)酵蛋白質(zhì)飼料的營養(yǎng)價(jià)值，為非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料資源的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 微生物發(fā)酵復(fù)合蛋白質(zhì)原料的制備

本研究選用的米曲霉是河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與生物技術(shù)研究室從牛的瘤胃中分離出來，經(jīng)23S rRNA鑒定后保存?zhèn)溆谩＞C合本研究室以前微生物發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，確定了米曲霉發(fā)酵復(fù)合蛋白質(zhì)原料的最佳配方是：麥麩35%、棉粕26%、羽毛粉4%、玉米粉5%、血粉30%；合適的發(fā)酵工藝條件：初始pH值為6、含水率50%、接種量為2%（米曲霉制成孢子濃度為1×109個(gè)/ml，）、最佳收獲時(shí)間為60 h；在上述工藝條件下，發(fā)酵產(chǎn)品中可溶性蛋白質(zhì)的含量是173.72 mg/g，氨基氮的含量是34.75 mg/g，游離氨基酸的總量是100.945 mg/g，粗蛋白質(zhì)的含量是48.97%；蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活性分別為2 341.83、36 780.8 U/g和6 835.43 U/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧組成

選擇7周齡AA肉雞25只（要求健康無病、個(gè)體重相近，單籠飼養(yǎng)），隨機(jī)分為5個(gè)試驗(yàn)組、每個(gè)試驗(yàn)組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞。試驗(yàn)Ⅰ組（對(duì)照組）基礎(chǔ)日糧為玉米-豆粕型，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別用發(fā)酵蛋白質(zhì)原料代替基礎(chǔ)日糧中90%、60%和30%豆粕，試驗(yàn)Ⅴ組用未發(fā)酵蛋白質(zhì)原料代替基礎(chǔ)日糧中60%豆粕（試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1）。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 營養(yǎng)物質(zhì)代謝率的測定

代謝試驗(yàn)利用全收糞法，預(yù)試期7 d，正試期3 d，采食量限制，自由飲水、自然光照，正試期每天準(zhǔn)確記錄每只雞的采食量，每天收集每只雞的排泄物1次，并適量噴灑10%硫酸，置冰箱存放，持續(xù)3 d后，將每只雞3 d的排泄物混合均勻，置于平皿中，在70℃溫度條件下烘干后稱重，粉碎過40目篩后留樣備用。使用常規(guī)方法來測定飼料與糞樣中粗脂肪（GB/T 6434—1994）、粗蛋白（GB/T 6432—1994）、鈣（GB/T 6436—1994）和磷（GB/T 6437—1994）的含量，用下列公式進(jìn)行計(jì)算。

營養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率（%）=（攝入養(yǎng)分量-排泄物中養(yǎng)分量）/攝入養(yǎng)分量×100。

1.4 微生物培養(yǎng)基的制備及胃腸道微生物區(qū)系和酶活分析

在正試期結(jié)束后，每組隨機(jī)選3只雞屠宰，快速打開腹腔，在無菌的條件下，采集大小腸兩部位的內(nèi)容物，利用生理鹽水（稀釋大腸桿菌用）或MRS培養(yǎng)液(稀釋乳酸菌用)稀釋糞便中的微生物至1×10-8左右，采用涂板計(jì)數(shù)法測定腸道中米曲霉（PDA培養(yǎng)基）、乳酸菌（MRS培養(yǎng)基）、大腸桿菌（伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基）的數(shù)量。微生物的數(shù)量利用對(duì)數(shù)值（lg）計(jì)算，并用每克腸道內(nèi)容物中的菌落形成數(shù)表示（cfu/g）。用Folin-酚法和Yoo改良法分別測定肉雞小腸內(nèi)容物蛋白酶與淀粉酶的活性。

培養(yǎng)米曲霉的PDA培養(yǎng)基：可溶性淀粉6 g、酵母 2 g、蛋白胨5 g、葡萄糖 20 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值6.5～7.0，在121℃和1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌15 min，制備固態(tài)平皿培養(yǎng)基備用。雞內(nèi)容物的稀釋液接種后在30℃下靜置培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)米曲霉的數(shù)量。

培養(yǎng)乳酸菌的MRS培養(yǎng)基制備：胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母5 g、葡萄糖20 g、檸檬酸三銨2 g、乙酸鈉5 g、吐溫80 1 ml、硫酸鎂200 mg、硫酸錳50 mg、磷酸氫二鈉2 g，pH值6.2～6.6,用蒸餾水溶解配至1 000 ml，高壓滅菌后備用。制備MRS固態(tài)厭氧培養(yǎng)基的流程為：將60 mg瓊脂粉放入Hungate厭氧管內(nèi)，加入MRS培養(yǎng)液3 ml，用CO2排出管內(nèi)的空氣，密封厭氧管,高壓滅菌，取出后放入50℃水浴鍋內(nèi)備用。取100 μl雞內(nèi)容物的稀釋液，接種于厭氧管后，快速在冰上旋轉(zhuǎn)，在37℃下靜置培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計(jì)乳酸菌的數(shù)量。

鑒別大腸桿菌的伊紅美蘭培養(yǎng)基的組成：蛋白胨 20 g、豬膽鹽5 g、乳糖5 g、瓊脂粉20 g、0.4%溴甲酚紫水溶液2.5 ml，蒸餾水1 000 ml，pH值7.4。高壓滅菌15 min后，制備固態(tài)平皿培養(yǎng)基備用。雞內(nèi)容物的稀釋液接種后在37℃下靜置培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)大腸桿菌的數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵蛋白產(chǎn)品對(duì)肉雞日糧營養(yǎng)物質(zhì)代謝率的影響（見表2）

表2 發(fā)酵蛋白產(chǎn)品對(duì)肉雞日糧養(yǎng)分代謝率的影響(%)

表2的結(jié)果顯示，消化率低的蛋白質(zhì)飼料通過微生物發(fā)酵后，其粗蛋白質(zhì)、鈣和總磷的代謝率顯著高于未發(fā)酵的蛋白質(zhì)組（P＜0.05）（試驗(yàn)Ⅱ組除外），尤其是以30%和60%豆粕替代組效果最好，與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05），然而對(duì)粗脂肪的代謝率無顯著性影響（P＞0.05）。說明在肉雞日糧中用30%～60%發(fā)酵蛋白來替代豆粕是可行的。

2.2 發(fā)酵蛋白產(chǎn)品對(duì)肉雞腸道菌群的影響（見表3）

表3 發(fā)酵蛋白產(chǎn)品對(duì)肉雞直腸中微生物菌群的影響（lg cfu/g)

從表3可以看出，肉雞通過飼喂微生物發(fā)酵蛋白的三種日糧后，其直腸中米曲霉數(shù)量顯著高于對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅴ組（P＜0.05）；乳酸菌數(shù)量與對(duì)照組相近，但顯著地高于未發(fā)酵蛋白質(zhì)組（P＜0.05）。只有30%和60%豆粕替代組肉雞直腸中的大腸桿菌數(shù)量顯著地低于其它三組（P＜0.05）。

2.3 發(fā)酵蛋白產(chǎn)品對(duì)肉雞小腸中消化酶活性的影響（見表4）

表4 發(fā)酵蛋白產(chǎn)品對(duì)肉雞小腸中消化酶活性的影響（U/g)

表4結(jié)果表明，三個(gè)發(fā)酵蛋白質(zhì)組與對(duì)照組和未發(fā)酵蛋白質(zhì)組相比，顯著地提高了肉雞小腸中蛋白酶和淀粉酶的活性（P＜0.05）；對(duì)照組肉雞小腸中蛋白酶和淀粉酶的活性顯著地高于未發(fā)酵蛋白質(zhì)組（P＜0.05），這說明未發(fā)酵蛋白質(zhì)對(duì)肉雞小腸中蛋白酶和淀粉酶的分泌有明顯的影響。

3 討論

3.1 發(fā)酵蛋白對(duì)肉雞營養(yǎng)物質(zhì)表觀代謝率的影響

蛋白質(zhì)飼料經(jīng)過微生物發(fā)酵處理后，其理化性質(zhì)得到明顯改變，很好地解決了低品質(zhì)蛋白質(zhì)飼料原料營養(yǎng)成分少、適口性差且含有抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒素等缺陷；同時(shí)，在發(fā)酵過程中，會(huì)產(chǎn)生許多小分子多肽和氨基酸，更有利于動(dòng)物的消化吸收，營養(yǎng)物質(zhì)代謝率得到顯著提高。何濤（2008）的研究結(jié)果說明，棉粕發(fā)酵后，在基礎(chǔ)日糧中代替20%豆粕時(shí)，肉仔雞的表觀蛋白質(zhì)代謝率與對(duì)照組相比，差異不顯著；楊遠(yuǎn)新等（2006）的研究表明，血粉發(fā)酵后，在基礎(chǔ)日糧中代替豆粕時(shí)，能明顯提高蛋白質(zhì)的代謝率、氮沉積量、氮沉積率等，與本試驗(yàn)研究的結(jié)果趨于一致。本研究表明，在肉雞基礎(chǔ)日糧中，使用30%～60%發(fā)酵復(fù)合蛋白質(zhì)原料代替豆粕，各種營養(yǎng)物質(zhì)的表觀代謝率與對(duì)照組相比差異不大，但當(dāng)替代率達(dá)90%時(shí)，顯著地降低日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。分析其原因可能是微生物發(fā)酵，不能徹底降解原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子與大分子蛋白質(zhì)；同時(shí)，添加量越大，抗?fàn)I養(yǎng)因子和不易消化吸收的蛋白質(zhì)在日糧中的含量就越高，從而影響了肉雞日糧中各種營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率。

本研究證明，與未發(fā)酵蛋白質(zhì)組相比較，發(fā)酵復(fù)合蛋白質(zhì)組能提高各種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝率，究其原因主要是未經(jīng)發(fā)酵復(fù)合蛋白中含有很多的有毒物質(zhì)、抗?fàn)I養(yǎng)因子和不易被消化吸收的大分子蛋白質(zhì)；而發(fā)酵復(fù)合蛋白產(chǎn)品中的這些物質(zhì)，通過微生物的發(fā)酵和酶解，數(shù)量明顯降低，進(jìn)而提高了各種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝率。

3.2 發(fā)酵蛋白對(duì)肉雞腸道微生物菌群和消化酶活性的影響

動(dòng)物消化道中存在大量的有益與無益微生物，在正常情況下，有益菌與無益菌之間相互作用，與動(dòng)物存在著共生關(guān)系，參與機(jī)體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收轉(zhuǎn)化、分解、代謝和合成等；同時(shí)，日糧中的營養(yǎng)成分與含量的變化對(duì)消化道中微生物菌群的數(shù)量有很明顯的影響。大量研究結(jié)果表明，畜禽飼料中添加適量微生物發(fā)酵飼料和益生菌產(chǎn)品，能顯著提高其消化道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量，從而抑制大腸桿菌的生長繁殖。何濤（2008）的研究結(jié)果證明，用微生物發(fā)酵棉粕代替日糧中部分豆粕，可調(diào)控肉用仔雞消化道中的微生態(tài)平衡，增加了有益菌群特別是乳酸菌的數(shù)量，抑制了大腸桿菌生長繁殖，從而減少了大腸桿菌的數(shù)量。趙江濤（2007）研究結(jié)果表明，在肉雞日糧中，用米曲霉固體發(fā)酵物按0.1%的量添加，可以使大腸桿菌的數(shù)量明顯降低，乳酸菌的數(shù)量顯著提高，而且米曲霉在腸道內(nèi)能大量定植，取得了與本研究結(jié)論趨于一致的結(jié)果。分析其原因，主要是米曲霉在對(duì)蛋白質(zhì)原料的發(fā)酵過程中，產(chǎn)生大量的活孢子能在腸道內(nèi)生長與繁殖，所以在直腸內(nèi)能檢測出許多米曲霉；另外，蛋白質(zhì)原料經(jīng)過米曲霉的發(fā)酵，還能生產(chǎn)大量的酶、代謝產(chǎn)物及一些生長因子等，從而增殖了腸道中乳酸菌等有益菌的數(shù)量，抑制大腸桿菌等有害菌的生長和繁殖。

3.3 發(fā)酵蛋白對(duì)肉雞腸道消化酶活性的影響

本研究結(jié)果還表明，發(fā)酵復(fù)合蛋白添加到肉雞日糧中，能顯著地提高肉雞小腸內(nèi)蛋白酶和淀粉酶的活性，這一結(jié)果與發(fā)酵復(fù)合蛋白中含有一定數(shù)量的外源蛋白酶和淀粉酶有關(guān)，此試驗(yàn)結(jié)果與馬文強(qiáng)等(2006)報(bào)道的結(jié)論基本一致。

4 結(jié)論

與未發(fā)酵蛋白質(zhì)組相比較，肉雞日糧中使用發(fā)酵復(fù)合蛋白替代30%～60%的豆粕，能顯著提高日糧中各種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝率（P＜0.05）（粗脂肪除外），并能顯著地提高肉雞腸道中乳酸菌的數(shù)量和消化酶的活性（P＜0.05），抑制大腸桿菌在肉雞腸道中生長繁殖，大腸桿菌的數(shù)量明顯減少（P＜0.05），試驗(yàn)為非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料資源的開發(fā)利用提供參考。

（參考文獻(xiàn)14篇，刊略，需者可函索）