■張廣亮 劉大森，2 呂宗浩 黃國欣 杜江華

（1.東北農業(yè)大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農業(yè)大學理學院，黑龍江哈爾濱 150030）

固氮菌是指具有生物固氮能力的細菌，根據習性被分為自生固氮菌、聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌。在科學界，對固氮菌的研究以在植物和土壤方面居多(Hurek等,1997;Bellenger等,2014)，但隨著生物固氮研究的深入，很多研究者們在動物體內也發(fā)現了固氮菌的存在，如Bergersen等（1970）在動物的腸道中分離到了具有固氮能力的細菌。反芻動物瘤胃微生物擔負著降解飼料等重要作用，自然對其研究比較多。但是，目前對瘤胃固氮菌分離和作用等研究還很少。Jones等（1974）和紀金春（1993）分別從山羊和綿陽瘤胃液中分離出具有固氮能力的細菌；冀德君等（2006）從山羊的瘤胃液中分離到了兼性厭氧的固氮菌，并做了初步鑒定；李昊等（2013）和仝泳等（2014）分別在奶牛瘤胃液中分離到了兼性厭氧的固氮菌，對菌株進行了初步鑒定，并發(fā)現兼性厭氧固氮菌和纖維菌混合添加比只添加纖維菌有益于瘤胃發(fā)酵。然而，現有研究都是有關瘤胃液的兼性厭氧固氮菌，缺少瘤胃飼料殘渣中此類菌的研究。

本試驗將從瘤胃液和瘤胃殘渣中分離兼性厭氧固氮菌，通過固氮酶活性，生理生化和分子鑒定指標，對瘤胃液和瘤胃殘渣中兼性厭氧固氮菌進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源

本試驗菌株是從3頭裝有永久性瘤胃瘺管、體況良好的荷斯坦奶牛采集的瘤胃液和瘤胃殘渣中分別進行分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

無氮固體培養(yǎng)基：每升含0.5 g Na2MoO4、1.36 g KH2PO4、2.13 g Na2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、0.1 g Ca-Cl2、0.2 g NaCl、0.01 g FeCl3、180 g純化瓊脂粉。

LB液體培養(yǎng)基：每升含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，pH值7.2。

1.1.3 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒（Code No.9763）購買自大連寶生物有限公司；PCR Premix溶液購買自北京金唯智生物有限公司；所用PCR引物由上海生工合成；16S rDNA測序工作由北京金唯智公司完成。

1.1.4 主要儀器

超級潔凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，DL-CJ-2ND型）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司，MCO-15AC型）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，LRH-250F）；氣相色譜儀（SHIMADZU,GC-2010型）；基因擴增儀（東勝創(chuàng)新生物有限公司，EDC-810）；電泳儀[EPS 601 POWER SUPPLY型，美國GE（瑞典amersham/pharmacia）]。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離和純化

在晨飼前采集瘤胃內容物，利用四層紗布將瘤胃液與瘤胃殘渣分離，瘤胃液和瘤胃殘渣分別在保溫容器內保存，迅速返回試驗室無菌操作臺中操作。稱10 g瘤胃殘渣溶入90 ml無菌水，為10-1，搖床搖20 min，之后與瘤胃液原液分別用無菌生理鹽水倍比稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍后涂布于無氮固體培養(yǎng)基中，39℃厭氧培養(yǎng)48 h后，在10-2和10-3倍稀釋情況下培養(yǎng)良好，挑取不同的單個菌落進行單獨培養(yǎng)，劃線接種于無氮固體培養(yǎng)基上，于39℃在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，反復多次，后又在有氧條件下培養(yǎng)幾次，直到在顯微鏡觀察下已經純化。純化后，觀察菌落特征（大小、顏色、形狀、邊緣、透明度等）并用革蘭氏法染色判斷陰陽性和用孔雀石綠染色判斷有無芽孢。生化鑒定參照《伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，利用杭州天和生物公司的細菌生化微量鑒定管進行生化鑒定。

1.2.2 固氮酶活性的測定

采用乙炔還原法進行固氮酶活性的測定。將菌株在平板無氮固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，用接種環(huán)挑取10個單個菌落劃線于試管中的斜面無氮培養(yǎng)基上。39℃培養(yǎng)72 h后將棉塞換成橡膠塞，注入乙炔氣體（最終濃度為10%,V/V），繼續(xù)培養(yǎng) 72 h，取100 μl反應氣體用氣相色譜儀測定其乙炔還原量(乙烯生成量)，并折算成固氮酶的活性（周建嬌，2013）。不接種空白培養(yǎng)基為陰性對照。

1.2.3 16S rDNA測序

菌株基因組DNA的提取，采用購買的細菌基因組DNA提取試劑盒操作（Code No.9763）。16S rDNA基因序列的PCR擴增，采用通用的簡并引物：上游引物27F:5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'，下游引物1492R:5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'。PCR反應在50 μl標準反應體系中進行（Code No.RR902A），PCR擴增條件為：首先，95℃預變性5 min；然后，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；最后，72℃延伸10 min。擴增產物置于4℃保存。取3 μl PCR產物和適量的Lording buffer混合進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，Marker為DL 2000，將純化（只有單一條帶）的PCR擴增產物送至北京金唯智生物科技有限公司測序。將測序結果在美國國立生物技術信息中心（NCBI）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上用BLAST軟件在Gen Bank中進行同源性分析和菌株序列號的申請，與相近典型菌株的基因序列相似度在99%以上可以判定與比較菌種為同一種屬，否則為同屬下的新亞種。

2 結果與分析

2.1 菌株的生理生化特征

從瘤胃液和瘤胃殘渣中分別篩選出6株固氮菌（編號從LY-1到LY-6）和4株固氮菌（編號從LC-1到LC-4），且這10株固氮菌均為兼性厭氧菌。10株固氮菌的革蘭氏染色和芽孢染色的結果見表1，就革蘭氏染色指標看，從瘤胃液中分離到了2株菌為革蘭氏陽性菌，其余都為陰性菌，然而，瘤胃殘渣中分離的均為革蘭氏陰性菌。從兩種來源都各自分離到了1株有芽孢的菌株，分別是LY-1和LC-1。生化鑒定結果見表2，在生化結果中，各菌株有些不同。

表1 菌株的染色鑒定結果

表2 菌株的生化鑒定結果

2.2 固氮酶活性

通過公式計算，菌株的固氮酶活性結果見表3。從表3結果可見，在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌體蛋白量基本上一致，從瘤胃液中分離到的6株菌株中，只有LY-1的固氮酶活性較高，其余5株都較低，從瘤胃殘渣中分離到的4株菌株的固氮酶活性均較高。

表3 菌株的固氮酶活性

2.3 菌株的16S rDNA鑒定

1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，圖中顯示所有菌株的PCR產物均在1 000～2 000 bp之間出現純化的單一條帶，無其他雜帶，且條帶明亮，表明得到的基因量很多。

圖1 菌株的PCR產物的電泳

測序結果顯示：獲得的基因片段大小都在1 400 bp左右。以瘤胃液為來源的6株固氮菌中，有3株鮑氏不動桿菌、1株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、1株索諾拉沙漠芽孢桿菌、1株山羊葡萄球菌。以瘤胃殘渣為來源的4株固氮菌中，有2株索諾拉沙漠芽孢桿菌、1株乙酸鈣不動桿菌新亞種、1株枝芽孢菌新亞種。根據結果來看，瘤胃液中的LY-5和LY-6為相同種屬的菌株，瘤胃液中的LY-3與瘤胃殘渣中的LC-2和LC-4為相同種屬的菌株。對應菌株最相似的種屬關系及相似度和菌株序列號，見表4。

3 討論

雖然反芻動物瘤胃是一個有復雜的微生物區(qū)系的厭氧環(huán)境，但在瘤胃中也存在著一定數量的兼性厭氧菌（鞏慶亮等，2008；Fan等，2012），瘤胃微生物中的大多數是嚴格厭氧的，他們遇到氧氣會立刻被殺死，然而氧氣會隨著飼喂飼料、飲水等方式進入瘤胃，進入的氧氣會被兼性厭氧菌所消耗，從而使瘤胃內保持為厭氧環(huán)境(Kamra，2005)。這些兼性厭氧菌雖然不是瘤胃內數量最多和最主要的細菌，但它們確實在瘤胃內起著一定的重要作用(Kato等，2004)。近些年，雖然有些學者對瘤胃的兼性厭氧菌做了一些研究，但對于瘤胃中兼性厭氧固氮菌的研究還相對較少。在本試驗中，從荷斯坦奶牛的瘤胃液中和瘤胃殘渣中共分離到了10株具有固氮酶活性的兼性厭氧菌株，并對其進行了16S rDNA基因測序鑒定，進一步證實了瘤胃內兼性厭氧固氮菌的存在。

表4 菌株的種屬關系及相似度

測定固氮酶活性時，菌株的菌體蛋白量均在0.001 5～0.002 3 mg之間（見表3），保證了菌株量不對固氮酶活性產生影響。綜合分子鑒定的結果來看，從同一來源中分離到的同一種菌屬菌株（LY-5和LY-6；LC-2和LC-4）的固氮酶活性基本相同，而從不同來源中分離到的同一種菌屬的菌株（LY-3和LC-2、LC-4）的固氮酶活性則有所不同，表明固氮菌的固氮能力是會根據來源環(huán)境等條件的不同而變化，菌株的固氮能力相對的（王子芳，1982）。分離到的同一種菌屬菌株在瘤胃殘渣中的固氮酶活性高于瘤胃液中的，這可能是因為瘤胃殘渣來源于外界，進入瘤胃時也會帶入一部分空氣，這種兼性厭氧菌會附著于殘渣中消耗氧氣并參與瘤胃發(fā)酵，使得酶活提高(Kato等，2004)；或者這種兼性厭氧菌本身就來源于外界，是隨著殘渣進入瘤胃的，一部分到了瘤胃液中，但其可能更適應有氧條件，在有氧的環(huán)境中活動更頻繁，活力更高，所以在無氧的瘤胃液中活性比較低。同時從分子鑒定的結果中發(fā)現，瘤胃液和瘤胃殘渣中都分離到的菌株是索諾拉沙漠芽孢桿菌，其余的菌株都只在一種來源中被分離到，這可能是因為并不是所有的兼性厭氧固氮菌都能生存在多種來源中，有的可能只生存在瘤胃液中，并不附著在殘渣上，有的相反；或者可能是分離過程所致，有的菌株可能兩種來源都存在，沒有都被分離到；又或者可能是有的菌株只在一種來源中酶活很高，數量很多，而在另一來源中則相反，導致只在一種來源被分離到。

從瘤胃液和瘤胃殘渣中都分離到了索諾拉沙漠芽孢桿菌。瘤胃中瘤胃液和瘤胃殘渣是充分混合存在的，而瘤胃殘渣多為日糧飼料或舔舐草料時帶入的塵土。所以瘤胃內的這種固氮菌有可能是從外界帶來的，這有待進一步研究。根據李昊等（2013）的研究結果，結合本試驗發(fā)現，兼性厭氧固氮菌和纖維菌混合添加比只有纖維菌的作用效果好，可能是因為添加的固氮菌會附著于飼料顆粒上，其活性高于瘤胃液中的，有利于飼料降解和瘤胃發(fā)酵。由于試驗中的兼性厭氧固氮菌來源于瘤胃，其宿主適應性和安全性能得到充分的保證，具有微生態(tài)制劑或飼用添加劑的開發(fā)價值（王炳曉等，2009）。

4 結論

分別從瘤胃液和瘤胃殘渣兩個來源分離得到6株和4株兼性厭氧固氮菌；在相同來源中同一種屬的固氮菌酶活性基本相同，不同來源中同一種屬的固氮菌的固氮酶活性差異較大；兩個來源中分離到了同一菌屬的菌株，即索諾拉沙漠芽孢桿菌，相似度在99%以上。