無動物源成分培養(yǎng)基用于人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的研究

任春紅1，張昕2

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)鏡中心；

2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)鏡中心中心實驗室，廣東汕頭515041)

摘要：目的建立一種無動物源成份無血清的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基XF/SF-MSCM，并探討其支持人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)體外增殖、維持分化潛能的效果。方法組織塊貼壁法分離獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細胞，P1代起分別使用自制的XF/SF-MSCM培養(yǎng)基與含10%胎牛血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基(SC-MSCM)對臍帶間充質(zhì)干細胞進行連續(xù)培養(yǎng)傳代至P6代，觀察比較兩組P6代細胞的形態(tài)及增殖能力，以流式細胞術(shù)檢測連續(xù)傳代后細胞的免疫學(xué)表型，比較其成骨、成脂肪的分化潛能。結(jié)果分離獲得的原代P0臍帶間充質(zhì)干細胞，分別在XF/SF-MSCM與SC-MSCM兩種培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)傳代，細胞增殖能力及形態(tài)無顯著差別。兩組P6代細胞的生長曲線相似，但XF/SF-MSCM組間充質(zhì)干細胞貼壁的緊密程度稍低；流式細胞檢測結(jié)果顯示，XF/SF-MSCM組細胞保持了間充質(zhì)干細胞的免疫學(xué)表型，高表達CD29、CD44、CD90，不表達CD31、CD34、CD45并維持了良好的成骨和脂肪細胞的分化能力。結(jié)論本室制備的無動物源成份無血清培養(yǎng)基XF/SF-MSCM可支持臍帶間充質(zhì)干細胞的體外擴增，維持其免疫學(xué)表型及分化潛能，提供數(shù)量充足的高質(zhì)量間充質(zhì)干細胞，滿足臨床治療及生物醫(yī)學(xué)研究的需要。

關(guān)鍵詞：臍帶間質(zhì)干細胞；無血清培養(yǎng)基；細胞培養(yǎng)；增殖

中圖分類號：R3

基金項目：中國博士后科學(xué)基金面上項目(NO：2013M531872)

作者簡介：任春紅(1975—)，女，山東青州人，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科主治醫(yī)師。

[收稿日期2014-11-17；責(zé)任編輯趙菊梅]

Culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells by

Xeno/serum-free medium

RENChun-hong1,ZHANGXin2*

(1.Endoscopic Center of the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,

Shantou,515041 China;2.Central Laboratory of the First Affiliated Hospital of Shantou

University Medical College,Shantou,515041 China)

Abstract：Objective To establish a xeno/serum-free medium for human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) and evaluate its capacity to support the expansion of hUC-MSCs in vitro.Methods Primary hUC-MSCs were isolated from Wharton's Jelly of umbilical cord of healthy newborn.Cells were respectively maintained and consecutively passaged in our homemade xeno/serum-free medium (XF/SF-MSCM) and conventional serum containing medium (SC-MSCM) as a control from passage1 (P1) to passage 6(P6).Cell morphology and proliferation were observed and compared.The immunological phenotype of P6 hUC-MSCs was analyzed by Flow Cytometry and the differentiation potency was also investigated.Results There is no significant difference in proliferation rate and morphology between hUC-MSCs cultured in X/SF-MSCM and SC-MSCM.The growth curve of P6 cells was similar when they were cultured in two culture systems.The P6 cells cultured in XF/SF-MSCM showed

MSCs specific surface marker expression phenotype:CD29+,CD44+,CD90+ and CD31-,CD34-,CD45-.Furthermore,P6cells maintained in XF/SF-MSCM could be induced to adipocyte and osteoplastic differentiation.Conclusion Our homemade XF/SF-MSCM for human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) can efficiently support the sequential passage and expansion of hUC-MSCs in vitro and maintain the differentiation potentials. The XF/SF-MSCM medium provides an efficient amplification system to produce sufficient and high quality MSCs for either clinical studies or applications.

Key words：Umbilical Cord mesenchymal stem cells; Serum-free medium; Cell culture; Proliferation

人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，極具臨床應(yīng)用價值。但為獲得足夠治療劑量的細胞，目前多采用含胎牛血清的培養(yǎng)基進行體外擴增，會帶來動物源性成分及病原體的污染，增加了MSCs臨床應(yīng)用的風(fēng)險[1]。因此，本室研制了一種無動物源性成分的MSCs專用無血清培養(yǎng)基用于hUC-MSCs的體外培養(yǎng)，并與含胎牛血清的培養(yǎng)基進行了平行對照研究，觀察了其對hUC-MSCs的增殖及分化潛能的維持效果，以期提高MSCs臨床應(yīng)用的安全性。

1材料與方法

1.1材料

人臍帶組織取自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科健康足月妊娠的剖宮產(chǎn)兒，組織使用經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)。DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)；重組人血清白蛋白(rHSA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、還原型谷胱甘肽(G-SH)、亞硒酸鈉及胰島素(Sigma)；胎牛血清(FBS，BiochromAG)；重組人表皮生長因子(rhEGF)與堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF，R&D)；L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA)、雙抗、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA及地塞米松(Gibco)；茜素紅、油紅(Oil-Red)-O、β-巰基乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶抑制劑、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、β-磷酸甘油及維生素C(Sigma)；抗人CD29-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC、CD45-PE單克隆抗體(四正柏公司)，CD31-FITC及CD44-FITC單克隆抗體(eBioscience)；倒置顯微鏡(Olympus)；AccuriC6流式細胞儀(BD)。

1.2方法

1.2.1臍帶的采集與準(zhǔn)備新鮮臍帶無菌采集后存放于含有肝素及抗生素的PBS中，置4℃冰盒內(nèi)帶回，4 h內(nèi)處理。

1.2.2組織塊貼壁法分離原代hUC-MSCs用含抗生素的PBS反復(fù)清洗臍帶，剝除臍帶外膜及動靜脈，將華爾通膠剪成1～2 mm3組織塊，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，間距2~5 mm，加少量含10%胎牛血清的DMEM/F12原代培養(yǎng)基，37℃、5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)24～48 h，后添加培養(yǎng)基至沒過組織塊；第7天換新鮮培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察細胞生長情況，每3～4 d更換1次培養(yǎng)基，10～14 d后去除組織塊。

1.2.3hUC-MSCs傳代和培養(yǎng)原代細胞長至約80%融合時，按1：1傳代，在兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別為實驗組(無血清培養(yǎng)基XF/SF-MSCM)和對照組(含血清培養(yǎng)基SC-MSCM)，按1∶3傳代。XF/SF-MSCM以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入10 g/LrHSA、胰蛋白酶抑制劑、NEAA、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、亞硒酸鈉、10 ng/mLrhEGF、10 ng/mLrhbFGF、L-谷氨酰胺、G-SH、氫化考的松、β-巰基乙醇及雙抗。SC-MSCM為含有10%FBS的DMEM/F12。

1.2.4細胞增殖狀況的比較hUC-MSCs分別在兩種培養(yǎng)基中連續(xù)傳至第6代，按照0.5×105/孔的密度接種于12孔板中。依次在細胞培養(yǎng)的第1~10天不同時間點進行計數(shù)，至細胞生長的平臺期止，繪制生長曲線，每個時間點設(shè)三個復(fù)孔，實驗重復(fù)三次。

1.2.5流式細胞術(shù)鑒定hUC-MSCs表型分別制備實驗組與對照組的P6代細胞懸液，10%山羊血清封閉15 min，后分別與熒光素標(biāo)記的抗人CD29-FITC、CD90-FITC、CD44-FITC、CD31-FITC、CD34-FITC和CD45-PE等單克隆抗體室溫避光孵育30 min，以FITC和PE標(biāo)記的小鼠IgG2bκ同型抗體為對照。PBS洗1次后重懸于400μlPBS，流式細胞分析。

1.2.6hUC-MSCs的成脂誘導(dǎo)分化取實驗組與對照組狀態(tài)良好的P6代hUC-MSCs，分別按2.5×104/孔接種于12孔板中，在XF/SF-MSCM與SC-MSCM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%融合，換為脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基：高糖DMEM加10%FBS、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、60 μmol/L吲哚美辛與5 μg/mL胰島素，每3 d更換培養(yǎng)基，連續(xù)誘導(dǎo)14 d，用2%油紅O染色鑒定分化細胞內(nèi)脂滴的形成。

1.2.7hUC-MSCs的成骨誘導(dǎo)分化取實驗組與對照組狀態(tài)良好的P6代hUC-MSCs，按1.0×104/孔的密度接種于12孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至50%～60%融合，換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含10%FBS的高糖DMEM中添加0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L維生素C和10 mmol/Lβ-磷酸甘油。每3～4 d更換1次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)2～3 W，鏡下觀察有無骨質(zhì)沉積結(jié)節(jié)，4%的多聚甲醛固定30 min；PBS洗滌后，1 mL茜素紅染液染色3～5 min，鏡下觀察、拍照記錄。

2結(jié)果

2.1hUC-MSCs分離、培養(yǎng)和形態(tài)觀察

組織貼壁法分離培養(yǎng)4 d左右，可觀察到少量梭形細胞從組織塊爬出。第8天，部分原代細胞在組織塊周圍呈單層生長(圖1A，B)，后逐漸融合。鏡下可見，兩種培養(yǎng)體系傳代后的細胞呈扁平的長梭形成纖維樣，形態(tài)均一，達80%融合時，細胞排列緊密，呈有極性的旋渦或指紋狀。同對照組相比，實驗組細胞貼壁的緊密程度稍低，但貼壁率及細胞的生長狀態(tài)無明顯差別(圖1C-F)。

圖1　人臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)

注：(100×)(A：培養(yǎng)4 d后的組織塊；B：培養(yǎng)8 d后的組織塊；C、D：XF/SF-MSCM中傳代培養(yǎng)第1天與第3天；E、F：SC-MSCM中傳代培養(yǎng)第1天與第3天)

2.2兩種培養(yǎng)體系中細胞的增殖能力

選取兩組連續(xù)傳至第6代的hUC-MSCs，觀察生長情況。結(jié)果可見，P6代細胞接種后，生長潛伏期(0～24 h)增殖緩慢，2 d后進入對數(shù)生長期，持續(xù)3～4 d，到第6天左右細胞生長進入平臺期(圖2)。實驗組與對照組細胞的生長曲線相似。

2.3hUC-MSCs免疫表型的測定

對在兩種培養(yǎng)基中連續(xù)傳至第6代的hUC-MSCs進行流式細胞檢測，結(jié)果顯示，連續(xù)傳代后，實驗組細胞高表達CD29、CD44、CD90，不表達造血干細胞標(biāo)志CD34、CD45及內(nèi)皮細胞標(biāo)志CD31(圖3)，說明在XF/SF-MSCM中連續(xù)傳代后，hUC-MSCs仍維持了特異性免疫表型。

圖2　第6代臍帶間充質(zhì)干細胞生長曲線

圖3　XF/SF-MSCM與SC-MSCM培養(yǎng)的第6代

2.4hUC-MSCs成骨、成脂肪分化能力檢測

圖4　間充質(zhì)干細胞多向分化潛能的鑒定

注：(A、C：SC-MSCM培養(yǎng)的第6代hUC-MSCs的成脂、成骨分化；B、D：XF/SF-MSCM培養(yǎng)的第6代hUC-MSCs的成脂、成骨分化)

使用兩種培養(yǎng)基中連續(xù)傳至第6代的hUC-MSCs，分別向成脂肪和成骨方向誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示，向脂肪誘導(dǎo)分化14 d后，鏡下可見在兩組細胞中均有大量脂滴形成，油紅O染色呈強陽性(圖4A，B)；對成骨誘導(dǎo)3周的細胞進行茜素紅染色，鏡下同樣可觀察到在兩組細胞中含大量深紅色骨質(zhì)鈣化結(jié)節(jié)(圖4C，D)，證明臍帶間充質(zhì)干細胞在XF/SF-MSCM培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后，仍保持了良好的向脂肪、骨等細胞的分化潛能。

3討論

1991年，McElreavey等從人臍帶華爾通膠(Wharton′sjelly，WJ)中發(fā)現(xiàn)并首次分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)。同骨髓、臍血來源的MSCs相比，hUC-MSCs倫理學(xué)爭議少、來源豐富、取材方便、增殖能力更強，并具有免疫原性低、調(diào)節(jié)免疫、支持造血、旁分泌、低致瘤性等優(yōu)點，因此顯示了更為廣闊的臨床應(yīng)用前景。為解決目前MSCs體外擴增普遍使用動物血清帶來的動物源性成分及病原體污染的問題，本室建立了一種無動物源性成分、成分明確的MSCs專用培養(yǎng)基XF/SF-MSCM：以DMEM/F12為基礎(chǔ)，添加了細胞生長必需的營養(yǎng)成分，保護細胞免受理化因素損傷的緩沖、抗氧化成分及可支持MSCs集落生成的rhEGF、rhbFGF等因子。

本研究在原代細胞分離過程中采用了組織塊貼壁法，以避免酶消化對細胞的損傷及臍帶中造血、內(nèi)皮細胞的污染[2-4]。結(jié)果顯示，組織塊貼壁培養(yǎng)1d后即有細胞游出，第10天相鄰組織塊間的細胞開始融合。傳代后細胞形態(tài)均一，其他類型細胞極少，流式細胞檢測顯示純度很高。

本研究自P1代細胞起即使用XF/SF-MSCM培養(yǎng)基進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，而未采取逐步替代血清的方法[5]。與對照組(SC-MSCM)相比，實驗組(XF/SF-MSCM)組細胞的增殖效率、細胞生長曲線及免疫學(xué)表型、成骨及成脂肪分化潛能均無差別。在連續(xù)傳代過程中，兩組細胞接種24h貼壁率無明顯差別(數(shù)據(jù)未顯示)，但鏡下觀察及傳代時胰酶消化的難易程度均顯示，實驗組細胞貼壁的緊密程度低于對照組，表明本培養(yǎng)基配方中仍缺乏促細胞貼壁因子，這也是目前無血清培養(yǎng)基普遍存在的問題。間充質(zhì)干細胞的貼壁率直接影響其生存與增殖，尤其在原代細胞分離過程中，常用解決方法是在培養(yǎng)介質(zhì)表面預(yù)鋪層粘連蛋白、纖粘連蛋白、I型膠原等促貼壁物質(zhì)[6-7]。本研究曾嘗試在未預(yù)鋪促貼壁物質(zhì)的條件下使用XF/SF-MSCM分離原代細胞，細胞獲得率遠低于血清培養(yǎng)基組(數(shù)據(jù)未顯示)。但促貼壁劑價格昂貴或為動物來源，并不適于臨床大規(guī)模制備細胞。目前大部分臨床研究仍將含胎牛血清的培養(yǎng)基用于原代細胞的分離，美國的FDA也允許使用動物血清，但對血清質(zhì)量及檢測做了嚴(yán)格規(guī)定。此外，也有實驗室開始使用人血小板裂解物作為血清替代物，效果較好[8]。

本研究結(jié)果顯示，本室的XF/SF-MSCM培養(yǎng)基能有效支持臍帶間充質(zhì)干細胞的體外擴增，且連續(xù)傳代后細胞仍保持其免疫學(xué)表型及分化潛能，為提供數(shù)量充足的高質(zhì)量間充質(zhì)干細胞用于臨床治療及生物醫(yī)學(xué)研究奠定實驗了方法學(xué)基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Kuo TK,Hung SP,Chuang CH,et al.Stem cell therapy for liver disease:parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells [J].Gastroenterology,2008,134(7):2111-2121.

[2]Patric Horn,Simone Bork,Wolfgan Wagner.Standardized Isolation of human Mesenchymal Stromal Cells with Red Blood cell lysis[M].2011.

[3]Broska M,Geiger H,Gauer E，et al.Epithelial differentiation of human adipose derived stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun 2005,330 (1): 142-150.

[4]Guilak F,Lott KE,Awad HA,et al.Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells[J].Cell Physiol,2006,206 (1): 229-237.

[5]張文成，王韞芳，常銘洋，等，臨床研究用間充質(zhì)干細胞的體外制備策略[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2012,(7)5: 327-332.

[6]Marastoni S,Ligresti G,Lorenzon E,et al.Extracellular matrix:a matter of life and death[J].Connect Tissue Res.2008,49(3):203-206.

[7]O'Brien FJ,Harley BA,Yannas IV,et al.The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds [J].Biomaterials,2005,26(4): 433-441.

[8]Bernardo ME,Avanzini MA,Perotti C,et al.Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches:further insights in the search for a fetal calf serum substitute[J].J Cell Physiol.2007,211(1):121-130.