塞來(lái)昔布對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

石國(guó)一，秦占川,劉玉玲,王敏

(贊皇縣醫(yī)院,河北贊皇 051230)

摘要：目的探討塞來(lái)昔布對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖、凋亡的影響及機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29，分別加入終濃度為10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞來(lái)昔布進(jìn)行干預(yù)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布及凋亡；Western blotting、RT-PCR法檢測(cè)Cox-2表達(dá)。結(jié)果塞來(lái)昔布干預(yù)后HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，且呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性(P均<0.05)。塞來(lái)昔布作用24 h后，HT-29細(xì)胞G0/G1期比例明顯升高，S期細(xì)胞比例降低(P均<0.05)；塞來(lái)昔布處理后細(xì)胞凋亡率明顯升高(P均<0.05)；細(xì)胞Cox-2蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低(P均<0.05)。結(jié)論 塞來(lái)昔布可體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與抑制Cox-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌；塞來(lái)昔布；HT-29細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Cox-2蛋白

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.013

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.35文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-06-10)

目前認(rèn)為，結(jié)腸癌發(fā)生可能與慢性炎癥刺激有關(guān)[1]，非甾體類(lèi)抗炎藥(NAIDs)可降低結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。Cox是NAIDs的主要作用靶點(diǎn)，包括Cox-1和Cox-2兩種亞型。Cox-2可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為多種前列腺素產(chǎn)物，在炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究[3]表明，結(jié)腸癌中可見(jiàn)到Cox-2過(guò)表達(dá)。塞來(lái)昔布是一種選擇性Cox-2抑制劑，對(duì)包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤具有抑制作用，并可增強(qiáng)化療藥物效果[4]，但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。2014年5月，我們探討了塞來(lái)昔布對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；塞來(lái)昔布購(gòu)自南京德寶生化器材有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； AnnexinV-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司；小鼠抗人Cox-2單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)大腸癌細(xì)胞株HT-29采用10%胎牛血清的McCoy′s 5A培養(yǎng)液培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整為單細(xì)胞懸液，接種于96孔板。10、20、40、80、160、320 μmol/L塞來(lái)昔布處理組分別加入終濃度為10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞來(lái)昔布，溶劑對(duì)照組給予DMSO。

1.3細(xì)胞生長(zhǎng)存活率測(cè)算細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)存活率：細(xì)胞生長(zhǎng)存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.4細(xì)胞周期及凋亡情況檢測(cè)收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/L。取0.5 mL細(xì)胞懸液，加入2 mL 75%冰乙醇，固定后檢測(cè)細(xì)胞周期。同時(shí)取0.5 mL細(xì)胞懸液，離心棄上清,加入0.5 mL Binding Buffer重懸細(xì)胞，按說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5HT-29細(xì)胞Cox-2蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。收集細(xì)胞，PBS洗滌后加入適量RIPA細(xì)胞裂解液，置冰上孵育1 h，4 ℃、12 000 r/min離心30 min。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量蛋白。每一處理組取等量蛋白，95 ℃變性5 min后冷卻上樣。變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉。加入1∶500稀釋的小鼠抗人Cox-2單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜。用1×TBS-T洗膜3次，每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的1∶5 000濃度的二抗，反應(yīng)1.5 h，洗膜后ECL發(fā)光法顯色。

1.6HT-29細(xì)胞Cox-2 mRNA檢測(cè)采用RT-PCR法。通過(guò)TRIzol一步法(Gibco公司)提取細(xì)胞總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)說(shuō)明書(shū)操作合成cDNA。PCR反應(yīng)體系：GoTaq Green Master 12.5 μL，上下游引物1 μL，2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加水至終體積25 μL。至PCR擴(kuò)增儀上，95 ℃變性5 min，94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。Cox-2引物上游5′-CAGAGTTG-GAAGCACTCTATGG-3′；下游5′-GGACAGCCCTTCA-CGTTATT-3′。PCR產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外分析儀觀察并照相，凝膠分析軟件分析各條帶平均灰度值。

2結(jié)果

2.1塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的影響在20～320 μmol/L濃度范圍內(nèi)，塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性(P均<0.05)。10 μmol/L濃度塞來(lái)昔布對(duì)細(xì)胞存活無(wú)明顯影響(P>0.05)。10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞來(lái)昔布作用24、48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)存活率見(jiàn)表1。

表1　 塞來(lái)昔布作用24、48 h后HT-29細(xì)胞

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞周期分布的影響與對(duì)照組相比，塞來(lái)昔布處理細(xì)胞24 h后， 20、40、80 μmol/L基來(lái)昔布處理組G0/G1期細(xì)胞百分比明顯升高(P均<0.05)。20、40、80 μmol/L塞來(lái)昔布處理組S期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯減低(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　塞來(lái)昔布處理后HT-29細(xì)胞周期分布比例

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.3塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響20、40和80 μmol/L塞來(lái)昔布處理24 h后，HT-29細(xì)胞凋亡率分別為(9.56±0.71)%、(13.36±1.55)%和(17.45±2.21)%，對(duì)照組為(6.60±0.58)%，與對(duì)照組比較，P均<0.05。

2.4塞來(lái)昔布對(duì)Cox-2蛋白及mRNA表達(dá)的影響40 μmol/L塞來(lái)昔布處理組與對(duì)照組Cox-2蛋白表達(dá)量分別為0.196±0.035、0.542±0.047，Cox-2 mRNA表達(dá)量分別為0.413±0.051、0.926±0.063，兩組Cox-2蛋白及mRNA表達(dá)比較，P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌是我國(guó)較常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。許多患者確診時(shí)已達(dá)晚期，不但喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，而且對(duì)放化療敏感性下降，5年生存率不到20%[5]。因此，尋找新的治療手段或藥物十分必要。NSAIDs具有降低結(jié)腸癌發(fā)病率的作用，對(duì)結(jié)腸癌的治療有重要意義。傳統(tǒng)NSAIDs同時(shí)影響Cox-1與Cox-2表達(dá)，可造成包括胃腸道出血等在內(nèi)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受到限制。塞來(lái)昔布是選擇性Cox-2抑制劑，可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖[6]，并增強(qiáng)放化療對(duì)腫瘤的殺傷作用[7]。與傳統(tǒng)NSAIDs相比，具有較好的耐受性[8]，因此具有較好的臨床應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布在體外可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖，提示其具有一定的抗腫瘤作用。

為了進(jìn)一步觀察塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制作用，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT-29細(xì)胞周期及凋亡情況。結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布作用后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，而S期細(xì)胞比例降低，提示HT-29細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞周期G0/G1期阻滯。與對(duì)照組相比，塞來(lái)昔布處理組細(xì)胞凋亡率明顯增高。提示塞來(lái)昔布可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)凋亡而發(fā)揮抑制HT-29細(xì)胞增殖的作用。這一過(guò)程可能涉及多個(gè)信號(hào)途徑，如NF-κB型號(hào)通路[9]、p53[10]等。

Cox-2對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)。Cox-2是一種誘導(dǎo)表達(dá)型酶，生理狀態(tài)下無(wú)表達(dá)或低水平表達(dá)，但在細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、致癌劑及某些癌基因產(chǎn)物的刺激下，其表達(dá)可明顯增加[11]，促進(jìn)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為多種前列腺素產(chǎn)物，在炎癥及腫瘤的發(fā)生中起到重要作用。前列腺素E2(PGE2)是一種重要的Cox-2催化產(chǎn)物，與腫瘤血管新生及腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、逃避免疫監(jiān)視等密切相關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Cox-2抑制劑可下調(diào)腫瘤細(xì)胞中PGE2水平，并抑制細(xì)胞增殖。選擇性Cox-2抑制劑如Celecoxib與其他藥物具有協(xié)同作用，可通過(guò)下調(diào)mTOR信號(hào)途徑活性抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]。本研究采用RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HT-29細(xì)胞中存在Cox-2表達(dá)。塞來(lái)昔布作用后，HT-29細(xì)胞中的Cox-2蛋白表達(dá)明顯下降，提示塞來(lái)昔布可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Cox-2表達(dá)水平抑制其催化產(chǎn)物如PGE2的生成，以及影響其他信號(hào)通路活性，從而抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，塞來(lái)昔布在體外可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞周期阻滯及凋亡，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞中Cox-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

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